【摘 要】
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为更好地研究靶向TrxR1的小分子化合物的细胞内靶点选择性，利用CRISPR/Cas9系统构建基因敲除TrxR1的HCT-116稳定细胞株。首先根据TrxR1基因序列和CRISPR/Cas9靶点设计原则，设计并选择合适的敲除位点，再根据敲除位点序列设计敲除TrxR1基因的sgRNA干扰序列，以pCasCMV-Puro-U6空质粒载体为骨架构建能表达该sgRNA干扰序列的重组质粒。质粒共转染至HCT
【基金项目】
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国家自然科学基金（82104011）； 安徽省自然科学基金（2108085MH319）； 安徽省重点研究与开发计划（202004a07020041）； 安徽省高校自然科学研究重大项目（KJ2019ZD30）；
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为更好地研究靶向TrxR1的小分子化合物的细胞内靶点选择性，利用CRISPR/Cas9系统构建基因敲除TrxR1的HCT-116稳定细胞株。首先根据TrxR1基因序列和CRISPR/Cas9靶点设计原则，设计并选择合适的敲除位点，再根据敲除位点序列设计敲除TrxR1基因的sgRNA干扰序列，以pCasCMV-Puro-U6空质粒载体为骨架构建能表达该sgRNA干扰序列的重组质粒。质粒共转染至HCT-116细胞后，加入嘌呤霉素，利用嘌呤霉素筛选TrxR1敲除的HCT-116细胞，通过DNA测序、免疫蛋白印迹、TRFS-green荧光探针和细胞内TrxR1酶活力检测等方法鉴定和验证HCT-116细胞的TrxR1基因敲除效果。进一步通过CCK-8实验初步研究靶向TrxR1小分子化合物对细胞内TrxR1酶活力和细胞增殖力抑制的相关性。结果显示，构建的表达sgRNA干扰序列的重组质粒可以敲除HCT-116细胞中TrxR1基因，筛选获得的稳定敲除细胞HCT116-TrxR1-KO中无TrxR1蛋白表达，而靶向TrxR1小分子抑制剂对该细胞无TrxR1酶活力和细胞增殖力抑制效果。从而证实利用CRISPR/Cas9系统成功构建了HCT-116的TrxR1基因敲除的稳定细胞株，并可用于研究靶向TrxR1的小分子化合物的细胞内作用靶点的特异性，为进一步研究TrxR1在相关疾病的发生机制和治疗中的作用奠定了基础。
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