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【关键词】菌肽宝;食用酒精;抑菌剂;发酵
【中图分类号】TS262 【文献标识码】A 【文章编号】1674-0688（2021）09-0042-04
酒精发酵是一个复杂的微生物反应过程[1-2]，淀粉质原料发酵生产食用酒精在发酵过程中杂菌的污染是酒精产率和品质下降的主要原因之一[3-4]。为了提高酒精产率，使用无抗食品级生物抑菌剂是抑制、减少杂菌或者杀灭杂菌在酒精发酵过程中急需解决的重大问题[5]。酒精发酵过程中常见且危害较大的杂菌主要有醋酸杆菌、丁酸菌、枯草芽孢杆菌、乳酸杆菌、野生酵母菌等[5-6]。而且，部分杂菌会代谢产出乙酸和乳酸降低发酵过程中醪液的pH，抑制部分辅料活力，降低酒精的产率[7-8]。传统酒精企业一般发酵时添加漂白粉、青霉素、安菌泰和克菌灵等含有抗药性的杀菌剂[9-13]，通过发酵副产物DDGS饲料作为动物营养的重要蛋白质来源，对酒精企业的经济效益做出重要贡献。但是，过量的使用以抗生素为主的杀菌剂，会使杂菌产生抗药性[14-15]，抑菌或杀菌不起作用，严重影响酒精发酵效果[16]。
食品级生物杀菌剂菌肽宝是从巴西引进的新一代绿色生物制剂产品，它具有广谱高效杀菌作用，对酒精发酵中出现的杂菌有较好的抑制作用，解决了食用酒精生产辅料添加合规性问题，它属于混合型天然抑菌剂，其成分主要是抑制细菌细胞壁合成破坏细菌、野生酵母菌和霉菌的细胞壁，使细胞壁中的糖苷键和肽键断裂，最后导致细菌死亡，对革兰氏阳性菌和棒杆菌极其敏感，抑制力强，效果好。因此，菌肽宝对酒精发酵的有害细菌和乳酸菌、醋菌、丁酸菌有明显的抑制作用，是目前为止比较有前景的酒精发酵专用抑制剂，并且符合《食品添加剂使用标准》（GB 2760 —2014标准）。
2019年，广西中粮生物质能源有限公司开展无抗杀菌剂的筛选，历时半年，将生产上使用的安菌泰与菌肽宝AK200、乳酸链球菌素、安菌宁和抑菌康4种无抗产品通过小试和大生产试验，成功筛选到一种菌肽宝AK200无抗食品级生物杀菌剂。该无抗杀菌剂成功筛选，践行了中粮集团质量安全管理红线，解决食用酒精生产中辅料添加合规性问题。
1 材料与方法
1.1 试剂与材料
生产车间陈化水稻液化醪、安菌宁、抑菌康、菌肽宝AK200（山东安茂康生物科技有限公司生产）、乳酸链球菌素（浙江新银象生物工程有限公司生产）、杰能科淀粉酶（杰能科中国生物工程有限公司生产）、隆科特糖化酶（山东隆科特酶制剂有限公司生产）、酸性蛋白酶（广西乐酵生物科技有限公司生产），发利酒用高活性干酵母（英联马利（北京）食品销售有限公司生产），安菌泰（柳州龙泰科技有限公司生产），氨水（含氮17%）、0.25%葡萄糖、0.5%次甲基蓝指示剂、斐林试剂、20%氢氧化钠、20%盐酸、65%硫酸，其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器
电子天平（梅特勒-托利多公司生产，型号：AL204）、工业天平（湘仪天平仪器设备有限公司生产，型号：TP-20 KF）、数字式黏度计（上海精天电子仪器有限公司生产，型号：NDJ-5S）、快速水分滴定仪（广州市艾安得有限公司生产，型号AND MF-50）、恒温水浴锅（江苏金坛市荣华仪器制造有限公司生产，型号：XMTD-204）、搅拌器（天津华兴伟业实验仪器有限公司生产，型号：D-8401型-WT）、精密型台式pH/电导率测量仪（梅特勒-托利多公司生产，型号：S40）、恒温培养振荡器（上海智诚分析仪器制造有限公司生产，型号：ZHWY-2102）、容量瓶、电子万用炉（北京市永光明医疗仪器有限公司生产，型号：一联电压，220 V ，功率为1 kW）、三角瓶等。
1.3 试验方法
1.3.1 食用酒精液化发酵工艺路线简述
食用酒精液化发酵工艺路线如下：水稻原料→粉碎→拌料→高温液化→同步糖化发酵→蒸馏→过滤→滤渣烘干→酒糙蛋白饲料→食用酒精[17]。
水稻原料预处理：将一定量的水稻通过预粉碎、分级筛除掉沙石、铁等其他杂物，再用筛网孔径为2.0 mm的粉碎机进行粉碎，在粉浆罐中添加工艺水、清液和中水，调配成一定干物浓度的粉浆后输送至液化工段。
液糖化及发酵：通过管线输送到粉浆罐内，按一半比例加入耐高温淀粉酶，物料搅拌混合均匀后进行喷射液化。闪冷后输送到液化罐，加入另一半淀粉酶，保温90 min至碘试检测液化合格。采用同步糖化发酵，即液化醪分别输入发酵罐和酒母罐，分批添加糖化酶。在活化罐内将活化好的酵母与液化醪连续输入酒母罐培养一段时间得到酒母醪，成熟的酒母醪与降温后的液化醪同时流入发酵罐，发酵生产乙醇，发酵70 h成熟后由泵输送到蒸馏工段。
蒸馏工艺：蒸馏采用五塔差压精馏流程。粗镏塔是将原料液进行初步分离，废醪输出离心;精塔是对粗塔塔顶收集的酒精进行提浓，排除废水，用于拌料;脱醛塔和脱甲醇塔主要分离甲醇和醛类物质，得到优质的食用酒精;其他工业酒精和杂醇油通过回收塔流出。精馏工艺采用的是差压耦合精馏技术。
饲料工段：饲料车间收集粗塔蒸除的废醪，添加板框过滤或卧螺离心机分离出清液和湿糟。部分清液回配，其余清液浓缩成糖浆，然后与湿糟进行均匀混配，通过管束干燥机干燥，出料水分小于12%，即为饲料（DDGS），再通過二级风送至饲料库房，包装。
1.3.2 不同杀菌剂小试发酵试验
取生产车间液化醪，用65%硫酸调节pH至4.40左右，检测液化醪固形物含量，分装已灭菌500 mL的三角瓶（400 g/瓶），摇匀。使用发利酒用活性干酵母为菌种，接种含量为0.1%液化醪，加入糖化酶0.68 kg/t粉、酸性蛋白酶0.06 kg/t粉，以加入5 mg·L-1的安菌泰杀菌剂、乳酸链球菌素、菌肽宝AK200、抑菌康、安菌宁5个因素条件进行发酵对比实验，以酒精度（%vol）、残总糖（%）、挥发酸（g·L-1）为判定指标，确定适合抑制发酵生产使用的无抗生物杀菌剂。用纱布封口，称重量，然后置于30 ℃、120 r/min的恒温摇床中培养，培养8 h后调节温度至33 ℃，静止发酵至70 h。发酵期间每天称1次重量，记录失重，发酵结束后检测残还原糖、残总糖、酒精度、酵母数等指标，同时进行液相色谱分析检测。 1.3.3 两种杀菌剂大生产发酵试验
在前期小试发酵试验基础上，将菌肽宝AK200作为发酵过程中添加的试验组，生产上现有的安菌泰作为试验对照组，2020年4月2～10日使用菌肽宝AK200进行生产试验，与使用安菌泰的发酵成熟醪液的生产数据指标进行对比。入料4 h前，往发酵罐添加2 kg菌肽宝AK200，然后每2 h往酒母罐里添加1 kg菌肽宝;入料4 h前，往发酵罐添加2 kg安菌泰，然后每2 h往酒母罐里添加1 kg安菌泰。
1.4 分析检测方法
醪液黏度检测：使用黏度计NDJ-5S;酒母质量检测：血球计数版法;蒸馏酒分检测：圆底烧杯蒸馏法;残总糖、残过滤总糖、残还原糖检测：斐林试剂法;挥发酸、酸度检测：中和滴定法;发酵成熟醪各试验组的测定采用高效液相色谱法，色谱条件：色谱柱，伯乐HPX-87H;流动相为0.005 mol /L H2SO4，泵流速为0.5 mL/L，柱温为65 ℃，RID设置温度为50 ℃，进样量为10μL，运行时间为30 min[18-21]。
1.5 计算公式
残淀粉（%）=（残总糖-过滤总糖）×0.9[22]
残糊精（%）=（过滤总糖-还原糖）×0.9[22]
2 结果与分析
2.1 不同杀菌剂小试化学检测结果
通过使用车间液化醪共进行了3批次重复小试试验研究，由表1中的检测结果可以看出，从成熟醪发酵失重、蒸馏酒分及残糖进行对比分析，安菌泰与菌肽宝AK200酒分一致且略高于其他3种杀菌剂，添加抑菌康的酒分最低，由于抑菌康和安菌宁只能对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌有抑制作用，因此不能起到有效的抑制其他细菌的作用。乳酸链球菌素[20]主要抑制枯草芽孢杆菌、乳酸杆菌和部分的梭菌属且pH越低效果越好，酒精发酵后pH会有所升高，但会降低抑菌杀菌效果。在产酸方面，抑菌康试验小组的酸度高，发酵效果不好，抑菌效果不太明显。总体来说，菌肽宝AK200杀菌剂的效果较好，相比其余3种杀菌剂，其发酵后的残糖偏低、产酸偏低、酒分偏高。综合发酵检测结果，发酵效果依次是菌肽宝AK200>抑菌康>安菌泰>安菌泰>乳酸链球菌素。实践证明，在淀粉质原料酒精发酵中无抗杀菌剂菌肽宝AK200替代原有安菌泰是可行的。
2.2 不同杀菌剂液相色谱检测结果
从表2可以看出，不同的5种杀菌剂的糖组分除DP4+含量相差较多外，其他还原性糖基本都被酵母利用，琥珀酸和乙酸含量都在可控范围以内。但是，乳酸链球菌素、抑菌康和安菌宁3种杀菌剂的乳酸含量对比其他2种的相差较大，说明发酵过程中可能出现染菌，抑菌杀菌效果不明显。乙醇与甘油比值是反映酒精发酵水平的一个重要指标，但是食用酒精中杂醇油的含量越低对分离提取效果越好，乙醇相对于副产物甘油的比值越高，说明发酵水平越高[23-24]，必须控制在合理的范围以内，数据显示添加菌肽宝Ak200发酵乙醇与甘油之比最高，说明发酵效果最好，副产物较低。
2.3 两种不同杀菌剂大生产试验
乙醇生产过程中产生的挥发酸主要是由酵母菌、乳酸菌及醋酸菌代谢生成，衡量乙醇产率的多少主要是看揮发酸含量的多少[20]。因此，生产过程中应尽可能地控制乙醇中挥发酸的含量。由图1可知，自4月2日4号发酵罐开始使用菌肽宝AK200后，24 h挥发酸逐渐下降，并稳定在0.20 mg·L-1以下，在各项液化出料温度、发酵温度可控的前提下，相对前期使用安菌泰效果稳定，未见异常波动。
从表3可以看出，在前段工序生产工艺一致的前提下，使用菌肽宝AK200后各项指标优于安菌泰，升酸差，较安菌泰低0.72 mg·L-1，挥发酸低于0.07 mg·L-1，残总糖、残淀粉和残糊精都有明显的下降，同时死亡率有所升高。
3 结论与讨论
本文使用广西中粮生物质能源有限公司生产线上陈化水稻粉进行小试和大生产多批次重复发酵试验，经过生产线上数据对比研究，菌肽宝复合型抑菌剂应用于酒精发酵抑菌控酸效果明显，能够及时地替代杀菌剂安菌泰，而且在现有生产工艺不变的情况下，对酵母的乙醇产率几乎没有影响，同时降低了残糖指标，有利于清液干物浓度降低和废液处理，节省企业生产成本。广西北海夏季温度较高，最高达40 ℃，而酒精发酵温度是影响酵母繁殖代谢的主要原因之一，同时会产生一些其他物质，温度过高不易抑制杂菌，因此需要加大酵母和杀菌剂的比例，以提高发酵效率和减少损失。
参 考 文 献
[1]张强.酒精发酵中杀菌剂的研究进展[J].化工进展，2016，35（4）：1167-1172.
[2]张家伟.克菌灵对酒精发酵常见杂菌抑制效果的研究[J].广西轻工业，2011，27（8）：11-12.
[3]孙振江，崔师泰，张倩勉，等.三种杀菌剂在木薯酒精发酵过程中的应用[J].轻工科技，2013，29（7）：1-2.
[4]潘汉勇.糖蜜发醇（四塔蒸馏法）生产优质食用酒精的技术控制分析[J].企业科技与发展，2017（3）：142-144.
[5]章克昌.酒精与蒸馏酒工艺学[M].北京：中国轻工业出版社，1995.
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食品级生物杀菌剂菌肽宝是从巴西引进的新一代绿色生物制剂产品，它具有广谱高效杀菌作用，对酒精发酵中出现的杂菌有较好的抑制作用，解决了食用酒精生产辅料添加合规性问题，它属于混合型天然抑菌剂，其成分主要是抑制细菌细胞壁合成破坏细菌、野生酵母菌和霉菌的细胞壁，使细胞壁中的糖苷键和肽键断裂，最后导致细菌死亡，对革兰氏阳性菌和棒杆菌极其敏感，抑制力强，效果好。因此，菌肽宝对酒精发酵的有害细菌和乳酸菌、醋菌、丁酸菌有明显的抑制作用，是目前为止比较有前景的酒精发酵专用抑制剂，并且符合《食品添加剂使用标准》（GB 2760 —2014标准）。
2019年，广西中粮生物质能源有限公司开展无抗杀菌剂的筛选，历时半年，将生产上使用的安菌泰与菌肽宝AK200、乳酸链球菌素、安菌宁和抑菌康4种无抗产品通过小试和大生产试验，成功筛选到一种菌肽宝AK200无抗食品级生物杀菌剂。该无抗杀菌剂成功筛选，践行了中粮集团质量安全管理红线，解决食用酒精生产中辅料添加合规性问题。
1 材料与方法
1.1 试剂与材料
生产车间陈化水稻液化醪、安菌宁、抑菌康、菌肽宝AK200（山东安茂康生物科技有限公司生产）、乳酸链球菌素（浙江新银象生物工程有限公司生产）、杰能科淀粉酶（杰能科中国生物工程有限公司生产）、隆科特糖化酶（山东隆科特酶制剂有限公司生产）、酸性蛋白酶（广西乐酵生物科技有限公司生产），发利酒用高活性干酵母（英联马利（北京）食品销售有限公司生产），安菌泰（柳州龙泰科技有限公司生产），氨水（含氮17%）、0.25%葡萄糖、0.5%次甲基蓝指示剂、斐林试剂、20%氢氧化钠、20%盐酸、65%硫酸，其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器
电子天平（梅特勒-托利多公司生产，型号：AL204）、工业天平（湘仪天平仪器设备有限公司生产，型号：TP-20 KF）、数字式黏度计（上海精天电子仪器有限公司生产，型号：NDJ-5S）、快速水分滴定仪（广州市艾安得有限公司生产，型号AND MF-50）、恒温水浴锅（江苏金坛市荣华仪器制造有限公司生产，型号：XMTD-204）、搅拌器（天津华兴伟业实验仪器有限公司生产，型号：D-8401型-WT）、精密型台式pH/电导率测量仪（梅特勒-托利多公司生产，型号：S40）、恒温培养振荡器（上海智诚分析仪器制造有限公司生产，型号：ZHWY-2102）、容量瓶、电子万用炉（北京市永光明医疗仪器有限公司生产，型号：一联电压，220 V ，功率为1 kW）、三角瓶等。
1.3 试验方法
1.3.1 食用酒精液化发酵工艺路线简述
食用酒精液化发酵工艺路线如下：水稻原料→粉碎→拌料→高温液化→同步糖化发酵→蒸馏→过滤→滤渣烘干→酒糙蛋白饲料→食用酒精[17]。
水稻原料预处理：将一定量的水稻通过预粉碎、分级筛除掉沙石、铁等其他杂物，再用筛网孔径为2.0 mm的粉碎机进行粉碎，在粉浆罐中添加工艺水、清液和中水，调配成一定干物浓度的粉浆后输送至液化工段。
液糖化及发酵：通过管线输送到粉浆罐内，按一半比例加入耐高温淀粉酶，物料搅拌混合均匀后进行喷射液化。闪冷后输送到液化罐，加入另一半淀粉酶，保温90 min至碘试检测液化合格。采用同步糖化发酵，即液化醪分别输入发酵罐和酒母罐，分批添加糖化酶。在活化罐内将活化好的酵母与液化醪连续输入酒母罐培养一段时间得到酒母醪，成熟的酒母醪与降温后的液化醪同时流入发酵罐，发酵生产乙醇，发酵70 h成熟后由泵输送到蒸馏工段。
蒸馏工艺：蒸馏采用五塔差压精馏流程。粗镏塔是将原料液进行初步分离，废醪输出离心;精塔是对粗塔塔顶收集的酒精进行提浓，排除废水，用于拌料;脱醛塔和脱甲醇塔主要分离甲醇和醛类物质，得到优质的食用酒精;其他工业酒精和杂醇油通过回收塔流出。精馏工艺采用的是差压耦合精馏技术。
饲料工段：饲料车间收集粗塔蒸除的废醪，添加板框过滤或卧螺离心机分离出清液和湿糟。部分清液回配，其余清液浓缩成糖浆，然后与湿糟进行均匀混配，通过管束干燥机干燥，出料水分小于12%，即为饲料（DDGS），再通過二级风送至饲料库房，包装。
1.3.2 不同杀菌剂小试发酵试验
取生产车间液化醪，用65%硫酸调节pH至4.40左右，检测液化醪固形物含量，分装已灭菌500 mL的三角瓶（400 g/瓶），摇匀。使用发利酒用活性干酵母为菌种，接种含量为0.1%液化醪，加入糖化酶0.68 kg/t粉、酸性蛋白酶0.06 kg/t粉，以加入5 mg·L-1的安菌泰杀菌剂、乳酸链球菌素、菌肽宝AK200、抑菌康、安菌宁5个因素条件进行发酵对比实验，以酒精度（%vol）、残总糖（%）、挥发酸（g·L-1）为判定指标，确定适合抑制发酵生产使用的无抗生物杀菌剂。用纱布封口，称重量，然后置于30 ℃、120 r/min的恒温摇床中培养，培养8 h后调节温度至33 ℃，静止发酵至70 h。发酵期间每天称1次重量，记录失重，发酵结束后检测残还原糖、残总糖、酒精度、酵母数等指标，同时进行液相色谱分析检测。 1.3.3 两种杀菌剂大生产发酵试验
在前期小试发酵试验基础上，将菌肽宝AK200作为发酵过程中添加的试验组，生产上现有的安菌泰作为试验对照组，2020年4月2～10日使用菌肽宝AK200进行生产试验，与使用安菌泰的发酵成熟醪液的生产数据指标进行对比。入料4 h前，往发酵罐添加2 kg菌肽宝AK200，然后每2 h往酒母罐里添加1 kg菌肽宝;入料4 h前，往发酵罐添加2 kg安菌泰，然后每2 h往酒母罐里添加1 kg安菌泰。
1.4 分析检测方法
醪液黏度检测：使用黏度计NDJ-5S;酒母质量检测：血球计数版法;蒸馏酒分检测：圆底烧杯蒸馏法;残总糖、残过滤总糖、残还原糖检测：斐林试剂法;挥发酸、酸度检测：中和滴定法;发酵成熟醪各试验组的测定采用高效液相色谱法，色谱条件：色谱柱，伯乐HPX-87H;流动相为0.005 mol /L H2SO4，泵流速为0.5 mL/L，柱温为65 ℃，RID设置温度为50 ℃，进样量为10μL，运行时间为30 min[18-21]。
1.5 计算公式
残淀粉（%）=（残总糖-过滤总糖）×0.9[22]
残糊精（%）=（过滤总糖-还原糖）×0.9[22]
2 结果与分析
2.1 不同杀菌剂小试化学检测结果
通过使用车间液化醪共进行了3批次重复小试试验研究，由表1中的检测结果可以看出，从成熟醪发酵失重、蒸馏酒分及残糖进行对比分析，安菌泰与菌肽宝AK200酒分一致且略高于其他3种杀菌剂，添加抑菌康的酒分最低，由于抑菌康和安菌宁只能对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌有抑制作用，因此不能起到有效的抑制其他细菌的作用。乳酸链球菌素[20]主要抑制枯草芽孢杆菌、乳酸杆菌和部分的梭菌属且pH越低效果越好，酒精发酵后pH会有所升高，但会降低抑菌杀菌效果。在产酸方面，抑菌康试验小组的酸度高，发酵效果不好，抑菌效果不太明显。总体来说，菌肽宝AK200杀菌剂的效果较好，相比其余3种杀菌剂，其发酵后的残糖偏低、产酸偏低、酒分偏高。综合发酵检测结果，发酵效果依次是菌肽宝AK200>抑菌康>安菌泰>安菌泰>乳酸链球菌素。实践证明，在淀粉质原料酒精发酵中无抗杀菌剂菌肽宝AK200替代原有安菌泰是可行的。
2.2 不同杀菌剂液相色谱检测结果
从表2可以看出，不同的5种杀菌剂的糖组分除DP4+含量相差较多外，其他还原性糖基本都被酵母利用，琥珀酸和乙酸含量都在可控范围以内。但是，乳酸链球菌素、抑菌康和安菌宁3种杀菌剂的乳酸含量对比其他2种的相差较大，说明发酵过程中可能出现染菌，抑菌杀菌效果不明显。乙醇与甘油比值是反映酒精发酵水平的一个重要指标，但是食用酒精中杂醇油的含量越低对分离提取效果越好，乙醇相对于副产物甘油的比值越高，说明发酵水平越高[23-24]，必须控制在合理的范围以内，数据显示添加菌肽宝Ak200发酵乙醇与甘油之比最高，说明发酵效果最好，副产物较低。
2.3 两种不同杀菌剂大生产试验
乙醇生产过程中产生的挥发酸主要是由酵母菌、乳酸菌及醋酸菌代谢生成，衡量乙醇产率的多少主要是看揮发酸含量的多少[20]。因此，生产过程中应尽可能地控制乙醇中挥发酸的含量。由图1可知，自4月2日4号发酵罐开始使用菌肽宝AK200后，24 h挥发酸逐渐下降，并稳定在0.20 mg·L-1以下，在各项液化出料温度、发酵温度可控的前提下，相对前期使用安菌泰效果稳定，未见异常波动。
从表3可以看出，在前段工序生产工艺一致的前提下，使用菌肽宝AK200后各项指标优于安菌泰，升酸差，较安菌泰低0.72 mg·L-1，挥发酸低于0.07 mg·L-1，残总糖、残淀粉和残糊精都有明显的下降，同时死亡率有所升高。
3 结论与讨论
本文使用广西中粮生物质能源有限公司生产线上陈化水稻粉进行小试和大生产多批次重复发酵试验，经过生产线上数据对比研究，菌肽宝复合型抑菌剂应用于酒精发酵抑菌控酸效果明显，能够及时地替代杀菌剂安菌泰，而且在现有生产工艺不变的情况下，对酵母的乙醇产率几乎没有影响，同时降低了残糖指标，有利于清液干物浓度降低和废液处理，节省企业生产成本。广西北海夏季温度较高，最高达40 ℃，而酒精发酵温度是影响酵母繁殖代谢的主要原因之一，同时会产生一些其他物质，温度过高不易抑制杂菌，因此需要加大酵母和杀菌剂的比例，以提高发酵效率和减少损失。
参 考 文 献
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