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[摘要] 目的 观察不同浓度七氟醚对人鼻咽癌细胞株CNE2黏附能力、CD133表达的影响。 方法 分为四组：对照组（Control组）、1.7%七氟醚组（Treat1组）、3.4%七氟醚组（Treat2组）和5.1%七氟醚组（Treat3组）。Treat1组、Treat2组和Treat3组人鼻咽癌CNE2细胞，经1.7%、3.4%、5.1%七氟醚作用2 h、4 h、6 h。检测细胞黏附率；采用qRT-PCR法检测CD133的mRNA表达。 结果 与处理前比较，Treat1组、Treat2组和Treat3组处理2 h、4 h和6 h时细胞黏附率降低，CD133的mRNA及其蛋白表达下调（P<0.05）。 结论 七氟醚可降低人鼻咽癌细胞株CNE2的黏附能力，且呈浓度和时间依赖性，其机制可能与下调CD133的表达有关。
[关键词] 麻醉药，吸入；细胞黏附；CD133
[中图分类号] R614 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2013）27-0001-02
七氟醚于1968年由Regan合成，1986年完成1期临床试验，1990年首先由日本的药监部门批准临床使用。近年来，被许多著名麻醉学专家誉为吸入麻醉的里程碑式药物。研究表明，七氟醚可抑制结肠癌细胞和喉癌细胞的生长以及肺癌细胞的黏附[1，2]，但七氟醚对人鼻咽癌细胞株黏附能力的影响尚不明确。CD133能在多种肿瘤细胞系中被检测到，并被证实表达CD133表型的肿瘤细胞是人类脑肿瘤、胃癌、肝细胞癌、结直肠癌、前列腺癌、黑色素瘤、胰腺癌等实体肿瘤中的干细胞，参与肿瘤的侵袭转移[3-5]。本研究拟评价七氟醚对人鼻咽癌细胞株CNE2黏附能力、CD133表达的影响，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 主要试剂与仪器
人鼻咽癌细胞株CNE2（南华大学研究所），RPMI 1640培养基、10%胎牛血清（Hyclone公司，美国），麻醉气体监测仪（Datex AS/3公司，芬兰），AestivaR/5型麻醉机（Datex Ohmeda公司，芬兰）。
1.2 细胞培养
CNE2细胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养。
1.3 实验分组
取对数生长期的人鼻咽癌CNE2细胞，采用随机数字表法将其随机分为四组：对照组（Control组）、1.7%七氟醚组（Treat1组）、3.4%七氟醚组（Treat2组）和5.1%七氟醚组（Treat3组）。
1.4 细胞黏附实验
分别处理好细胞将100 μL细胞悬液加入96孔板中，继续培养1 h。每孔加入200 μL PBS，振摇5 min，洗2遍。弃PBS后加入MTT，于波长490 nm处，用酶标仪测定吸光度值，并计算黏附率=[（各实验孔黏附细胞吸光度值/对照孔黏附细胞吸光度值-1）×100%]。
1.5 CD133 mRNA表达的测定
采用qRT-PCR法测定CD133 mRNA的表达，qRT-PCR反应：反应体系为20 μL，包括稀释后的RT产物2 μL、2×qRT-PCR缓冲液10 μL、5 μmol/L miR-155特异性PCR引物0.4 μL、5 U/μL耐热DNA聚合酶0.2 μL、灭菌双蒸水7.4 μL。反应条件：先95℃ 3 min活化Taq酶，然后95℃ 12 s、62℃ 35 s，共40个循环。
1.6 统计学处理
采用SPSS 16.0统计学软件进行分析，组间比较采用单因素方差分析，组内比较采用重复测量设计的方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 四组人鼻咽癌细胞株CNE2细胞黏附率的比较
见表1，与处理前比较，Treat1组、Treat2组和Treat3组处理2 h、4 h和6 h细胞黏附率降低（P<0.05）；与处理2 h比较，Treat2组和Treat3组处理4和6 h细胞黏附率降低（P<0.05）；与处理4 h比较，Treat2组和Treat3组处理6 h细胞黏附率降低（P<0.05）；与Control组比较，Treat1组、Treat2组和Treat3组处理2 h、4 h和6 h细胞黏附率降低（P<0.05）；与Treat1组比，Treat2组和Treat3组处理2、4和6 h细胞黏附率降低（P<0.05）；与Treat2组比，Treat3组处理2 h、4 h和6 h细胞黏附率降低（P<0.05）。
2.2 四组人鼻咽癌细胞株CNE2细胞CD133 mRNA表达改变
见表2，与处理前比较，Treat1组、Treat2组和Treat3组处理2 h、4 h和6 h细胞CD133的mRNA表达下调（P<0.05）；与处理2 h比较，Treat2组和Treat3组处理4 h和6 h细胞CD133的mRNA表达下调（P<0.05）；与处理4 h比较，Treat2组和Treat3组处理6 h细胞CD133的mRNA表达下调（P<0.05）；与Control组比较，Treat1组、Treat2组和Treat3组处理2、4和6 h细胞CD133的mRNA表达下调（P<0.05）；与Treat1组比，Treat2组和Treat3组处理2 h、4 h和6 h细胞CD133的mRNA表达下调（P<0.05）；与Treat2组比，Treat3组处理2 h、4 h和6 h细胞CD133的mRNA表达下调（P<0.05）。
3 讨论
鼻咽癌发病常见于南方数省，以广东省为高发区，在东南亚，鼻咽癌也是一种常见的肿瘤，此外，高发区还包括了阿拉斯加的爱斯基摩人和格陵兰土著人。据世界卫生组织估计，世界上80%的鼻咽癌发生在中国，居头面部恶性肿瘤首位。像其他许多上皮来源的恶性肿瘤一样，它是一种多步骤、多基因参与的遗传性肿瘤。到目前为止，研究已证实鼻咽癌在发生、发展过程中存在着许多遗传分子的异常改变，如癌基因过表达或活性过高以及抑癌基因低表达或功能缺失[5-8]。 本研究结果表明，与对照组比较，经不同浓度的七氟醚处理后细胞黏附率依次降低，与处理前比较，处理2 h、4 h和6 h，不同浓度七氟醚组细胞黏附率依次降低，提示七氟醚可降低人鼻咽癌细胞株CNE2的黏附能力，且呈浓度和时间依赖性。CD133抗原是一种分子量为117 kDa，具有5个跨膜域的糖蛋白，C末端结构域形成2个小环结构，N端结构域形成2个大环结构，编码865个氨基酸[9]。CD133常表达于人未成熟的造血干细胞、胚胎上皮细胞、神经前体细胞及内皮祖细胞中，在成熟的血细胞、神经细胞及内皮细胞里基本没有表达，进一步证实表达CD133表型的肿瘤细胞是人类脑肿瘤、胃癌、黑色素瘤、胰腺癌等实体肿瘤中的干细胞。本研究结果表明，与处理前比较，处理2 h、4 h和6 h时，不同浓度七氟醚组CD133表达依次下调；与对照组比较，经1.7%、3.4%和5.1%的七氟醚处理后CD133表达依次下调，提示七氟醚降低人鼻咽癌细胞株CNE2的黏附能力可能与其抑制CD133的表达有关。
综上所述，七氟醚可降低人鼻咽癌CNE2的黏附能力，且呈浓度和时间依赖性，其机制可能与下调CD133的表达有关。
[参考文献]
[1] Kvolik S，Dobrosevic B，Marczi S，et al. Different apoptosis ratios and gene expressions in two human cell lines after sevoflurane anaesthesia[J].Acta Anaesthesiol Scand，2009，53（9）：1192-1199.
[2] 黄翔，杨承祥，梁桦. 不同浓度七氟醚对人肺腺癌细胞株A549黏附能力、CD24和CD44v6表达的影响[J]. 中华麻醉学杂志，2012，63（1）：60-63.
[3] Wen L，Chen XZ，Yang K，et al. Prognostic value of cancer stem cell marker CD133 expression in gastric cancer：A systematic review[J]. PLoS One，2013，8（3）：e59154.
[4] Arndt K，Grinenko T，Mende N，et al. CD133 is a modifier of hematopoietic progenitor frequencies but is dispensable for the maintenance of mouse hematopoietic stem cells[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2013，110（14）：5582-5587.
[5] O’Brien CA，Pollett A，Gallinger S，et al. A human colon cancer cell capable of initiating tumour growth in immunodeficient mice[J]. Nature，2007，445（7123）：106-110.
[6] Acikalin MF，Etiz D，Gurbuz MK，et al. Prognostic significance of galectin-3 and cyclin D1 expression in undifferentiated nasopharyngeal carcinoma[J]. Med Oncol，2012，29（2）：742-749.
[7] Peng G，Wang T，Yang KY，et al. A prospective，randomized study comparing outcomes and toxicities of intensity-modulated radiotherapy vs. conventional two-dimensional radiotherapy for the treatment of nasopharyngeal carcinoma[J]. Radiother Oncol，2012，104（3）：286-293.
[8] Luo WR，Wu AB，Fang WY，et al. Nuclear expression of N-cadherin correlates with poor prognosis of nasopharyngeal carcinoma[J]. Histop-athology，2012，61（2）：237-246.
[9] Yin S，Li J，Hu C，et al. CD133 positive hepatocellular carcinoma cells possess high capacity for tumorigenicity[J]. Int J Cancer，2007， 120（7）：1444-1450.
（收稿日期：2013-07-17）
[关键词] 麻醉药，吸入；细胞黏附；CD133
[中图分类号] R614 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2013）27-0001-02
七氟醚于1968年由Regan合成，1986年完成1期临床试验，1990年首先由日本的药监部门批准临床使用。近年来，被许多著名麻醉学专家誉为吸入麻醉的里程碑式药物。研究表明，七氟醚可抑制结肠癌细胞和喉癌细胞的生长以及肺癌细胞的黏附[1，2]，但七氟醚对人鼻咽癌细胞株黏附能力的影响尚不明确。CD133能在多种肿瘤细胞系中被检测到，并被证实表达CD133表型的肿瘤细胞是人类脑肿瘤、胃癌、肝细胞癌、结直肠癌、前列腺癌、黑色素瘤、胰腺癌等实体肿瘤中的干细胞，参与肿瘤的侵袭转移[3-5]。本研究拟评价七氟醚对人鼻咽癌细胞株CNE2黏附能力、CD133表达的影响，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 主要试剂与仪器
人鼻咽癌细胞株CNE2（南华大学研究所），RPMI 1640培养基、10%胎牛血清（Hyclone公司，美国），麻醉气体监测仪（Datex AS/3公司，芬兰），AestivaR/5型麻醉机（Datex Ohmeda公司，芬兰）。
1.2 细胞培养
CNE2细胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养。
1.3 实验分组
取对数生长期的人鼻咽癌CNE2细胞，采用随机数字表法将其随机分为四组：对照组（Control组）、1.7%七氟醚组（Treat1组）、3.4%七氟醚组（Treat2组）和5.1%七氟醚组（Treat3组）。
1.4 细胞黏附实验
分别处理好细胞将100 μL细胞悬液加入96孔板中，继续培养1 h。每孔加入200 μL PBS，振摇5 min，洗2遍。弃PBS后加入MTT，于波长490 nm处，用酶标仪测定吸光度值，并计算黏附率=[（各实验孔黏附细胞吸光度值/对照孔黏附细胞吸光度值-1）×100%]。
1.5 CD133 mRNA表达的测定
采用qRT-PCR法测定CD133 mRNA的表达，qRT-PCR反应：反应体系为20 μL，包括稀释后的RT产物2 μL、2×qRT-PCR缓冲液10 μL、5 μmol/L miR-155特异性PCR引物0.4 μL、5 U/μL耐热DNA聚合酶0.2 μL、灭菌双蒸水7.4 μL。反应条件：先95℃ 3 min活化Taq酶，然后95℃ 12 s、62℃ 35 s，共40个循环。
1.6 统计学处理
采用SPSS 16.0统计学软件进行分析，组间比较采用单因素方差分析，组内比较采用重复测量设计的方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 四组人鼻咽癌细胞株CNE2细胞黏附率的比较
见表1，与处理前比较，Treat1组、Treat2组和Treat3组处理2 h、4 h和6 h细胞黏附率降低（P<0.05）；与处理2 h比较，Treat2组和Treat3组处理4和6 h细胞黏附率降低（P<0.05）；与处理4 h比较，Treat2组和Treat3组处理6 h细胞黏附率降低（P<0.05）；与Control组比较，Treat1组、Treat2组和Treat3组处理2 h、4 h和6 h细胞黏附率降低（P<0.05）；与Treat1组比，Treat2组和Treat3组处理2、4和6 h细胞黏附率降低（P<0.05）；与Treat2组比，Treat3组处理2 h、4 h和6 h细胞黏附率降低（P<0.05）。
2.2 四组人鼻咽癌细胞株CNE2细胞CD133 mRNA表达改变
见表2，与处理前比较，Treat1组、Treat2组和Treat3组处理2 h、4 h和6 h细胞CD133的mRNA表达下调（P<0.05）；与处理2 h比较，Treat2组和Treat3组处理4 h和6 h细胞CD133的mRNA表达下调（P<0.05）；与处理4 h比较，Treat2组和Treat3组处理6 h细胞CD133的mRNA表达下调（P<0.05）；与Control组比较，Treat1组、Treat2组和Treat3组处理2、4和6 h细胞CD133的mRNA表达下调（P<0.05）；与Treat1组比，Treat2组和Treat3组处理2 h、4 h和6 h细胞CD133的mRNA表达下调（P<0.05）；与Treat2组比，Treat3组处理2 h、4 h和6 h细胞CD133的mRNA表达下调（P<0.05）。
3 讨论
鼻咽癌发病常见于南方数省，以广东省为高发区，在东南亚，鼻咽癌也是一种常见的肿瘤，此外，高发区还包括了阿拉斯加的爱斯基摩人和格陵兰土著人。据世界卫生组织估计，世界上80%的鼻咽癌发生在中国，居头面部恶性肿瘤首位。像其他许多上皮来源的恶性肿瘤一样，它是一种多步骤、多基因参与的遗传性肿瘤。到目前为止，研究已证实鼻咽癌在发生、发展过程中存在着许多遗传分子的异常改变，如癌基因过表达或活性过高以及抑癌基因低表达或功能缺失[5-8]。 本研究结果表明，与对照组比较，经不同浓度的七氟醚处理后细胞黏附率依次降低，与处理前比较，处理2 h、4 h和6 h，不同浓度七氟醚组细胞黏附率依次降低，提示七氟醚可降低人鼻咽癌细胞株CNE2的黏附能力，且呈浓度和时间依赖性。CD133抗原是一种分子量为117 kDa，具有5个跨膜域的糖蛋白，C末端结构域形成2个小环结构，N端结构域形成2个大环结构，编码865个氨基酸[9]。CD133常表达于人未成熟的造血干细胞、胚胎上皮细胞、神经前体细胞及内皮祖细胞中，在成熟的血细胞、神经细胞及内皮细胞里基本没有表达，进一步证实表达CD133表型的肿瘤细胞是人类脑肿瘤、胃癌、黑色素瘤、胰腺癌等实体肿瘤中的干细胞。本研究结果表明，与处理前比较，处理2 h、4 h和6 h时，不同浓度七氟醚组CD133表达依次下调；与对照组比较，经1.7%、3.4%和5.1%的七氟醚处理后CD133表达依次下调，提示七氟醚降低人鼻咽癌细胞株CNE2的黏附能力可能与其抑制CD133的表达有关。
综上所述，七氟醚可降低人鼻咽癌CNE2的黏附能力，且呈浓度和时间依赖性，其机制可能与下调CD133的表达有关。
[参考文献]
[1] Kvolik S，Dobrosevic B，Marczi S，et al. Different apoptosis ratios and gene expressions in two human cell lines after sevoflurane anaesthesia[J].Acta Anaesthesiol Scand，2009，53（9）：1192-1199.
[2] 黄翔，杨承祥，梁桦. 不同浓度七氟醚对人肺腺癌细胞株A549黏附能力、CD24和CD44v6表达的影响[J]. 中华麻醉学杂志，2012，63（1）：60-63.
[3] Wen L，Chen XZ，Yang K，et al. Prognostic value of cancer stem cell marker CD133 expression in gastric cancer：A systematic review[J]. PLoS One，2013，8（3）：e59154.
[4] Arndt K，Grinenko T，Mende N，et al. CD133 is a modifier of hematopoietic progenitor frequencies but is dispensable for the maintenance of mouse hematopoietic stem cells[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2013，110（14）：5582-5587.
[5] O’Brien CA，Pollett A，Gallinger S，et al. A human colon cancer cell capable of initiating tumour growth in immunodeficient mice[J]. Nature，2007，445（7123）：106-110.
[6] Acikalin MF，Etiz D，Gurbuz MK，et al. Prognostic significance of galectin-3 and cyclin D1 expression in undifferentiated nasopharyngeal carcinoma[J]. Med Oncol，2012，29（2）：742-749.
[7] Peng G，Wang T，Yang KY，et al. A prospective，randomized study comparing outcomes and toxicities of intensity-modulated radiotherapy vs. conventional two-dimensional radiotherapy for the treatment of nasopharyngeal carcinoma[J]. Radiother Oncol，2012，104（3）：286-293.
[8] Luo WR，Wu AB，Fang WY，et al. Nuclear expression of N-cadherin correlates with poor prognosis of nasopharyngeal carcinoma[J]. Histop-athology，2012，61（2）：237-246.
[9] Yin S，Li J，Hu C，et al. CD133 positive hepatocellular carcinoma cells possess high capacity for tumorigenicity[J]. Int J Cancer，2007， 120（7）：1444-1450.
（收稿日期：2013-07-17）