【摘 要】
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目的:本研究旨在获得血管性血友病因子裂解酶ADAMTS 13中重组的spacer区蛋白,进一步探讨该区域对ADAMTS 13功能发挥的作用.方法:以ADAMTS13全长质粒为模板,构建含spacer区基
【机 构】
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苏州大学附属第一医院,江苏省血液研究所,卫生部血栓与止血重点实验室,血液学协同创新中心,江苏苏州215000苏州大学附属儿童医院血液科,江苏苏州,215000;
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目的:本研究旨在获得血管性血友病因子裂解酶ADAMTS 13中重组的spacer区蛋白,进一步探讨该区域对ADAMTS 13功能发挥的作用.方法:以ADAMTS13全长质粒为模板,构建含spacer区基因序列的原核表达质粒,转染大肠杆菌,低温(30℃)IPTG诱导表达,收集超声上清并鉴定.并大规模诱导表达,利用Ni-NTA琼脂糖柱,梯度咪唑淋洗法纯化蛋白,应用SDS-PAGE和Western blot法鉴定纯化产品纯度和免疫学活性.利用重组蛋白与免疫性调节的血栓性血小板减少性紫癜(iTTP)患者血浆孵育,检测血浆中ADAMTS 13的活性变化.结果:成功构建能表达spacer区的原核表达质粒并能有效表达蛋白.Western blotting结果显示,抗6×His抗体和抗人ADAMTS13抗体(针对Gln34-Trp688)分别能与重组蛋白在15 kDa处显单一条带.功能实验表明,该重组蛋白能够有效逆转iTTP患者中被自身抗体抑制的ADAMTS13酶活性.结论:重组蛋白具有较好的免疫原活性和纯度,为进一步研究spacer区对iTTP的发病机理提供了实验依据.
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