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摘 要：哺乳动物的精子结合到与输卵管尾部上皮细胞顶端表层上配糖体有关的末端碳水化合物上，并遭受与输卵管前获能有关的细胞和分子修饰。与此相反，鸡的精子能在子宫阴道结合部（Uterovaginal Junction，UVJ）的精子储存小管（Sperm-storage Tubules，SST）中储存长达23 d。
目前，对于调节精子在SST中储存和从中释放的细胞学和分子学机理几乎一无所知。本研究的目的是利用外源凝集素鉴定与SST上皮细胞表面相关联的复合糖。
本研究使用了6～16周产蛋上有较高和较低受精率的未产蛋母鸡和产蛋母鸡。含SST的UVJ黏膜切片用荧光共轭凝集素染色，通过共聚焦显微镜镜检。与UVJ和SST上皮细胞有关的一部分碳水化合物在它们的凝集素结合模式上存在差异。
未产蛋母鸡、幼龄母鸡和老年鸡在这两种上皮细胞内的凝集素结合模式上有明显差异，高受精率和低受精率的母鸡则存在微小差异。仅对半乳糖和N-乙酰半乳糖胺成分有特异性的外源凝集素位于SST腔表面。
虽然储存下来的精子可能被非常紧密地排列在SST上皮细胞顶端微绒毛上，但精子通过与复合糖相关的终端碳水化合物结合到微绒毛上，似乎并不是其延长储存时间的必要条件。
然而，SST上皮细胞与储存精子通过蜕落的微绒毛囊泡（其特征为表面含有终端半乳糖的复合糖和N-乙酰半乳糖胺成分）进行信息交流的可能性目前正在研究。
关键词：输卵管；精子储存；肉种鸡；复合糖
中图分类号：S814 文献标识码：C 文章编号：1001-0769（2017）02-0022-07
雌性家禽在自然交配或人工授精之后能够较长时间使精子保持活力。授精后，精子在阴道内会经历强烈的选择过程。被选中的精子群会被运输到近卵巢方向的子宫阴道接合部（Utero-vaginal Junction，UVJ），随后精子进入上皮细胞离散的管状内陷部——精子储存管（Sperm-storage Tubules，SST）中。
在随后的数天或数周中，储存在SST中的精子被逐步从SST中释放出来，上行至输卵管前端，并与随后排出的卵相互作用完成受精。Bakst（1993；2011）、Das等（2008）和Froman等（2003）对SST上皮细胞及其周围疏松结缔组织细胞以及相对于SST中的和从SST释放出储存精子的精子行为的可能作用分别进行了综述。
在哺乳动物中，复合糖通过选择性地将精子结合到输卵管峡部上皮细胞的顶部表面而使其成为构建精子储存库所必需的部分[参见Suarez（2008）、Talevi和Gualtieri（2010）的综述]。
Ignotz等（2001）介绍了精子贮库的三大功能：通过只允许相对较少的精子在排卵期到达受精的部位以减少多精入卵的可能性；维持精子在精子输送到雌性动物体内至排卵这段时间内的精子活力和受精力；促进精子获能并获得极大的活力。
与鸡精子质膜相关联的复合糖参与阴道中的精子选择、精子通过阴道向子宫阴道接合部的近子宫运输（Froman和Engel，1989；Steele和Wishart，1996）及精子与内部卵黄周围层间的相互作用。邻近SST上皮细胞的鸡精子呈紧密排列（Tingari和Lake，1973）或与SST上皮细胞相结合（Ahammad等，2011）的状态。
Schuppin等（1984）认为，只有当火鸡的SST腔内充满了精子时，它们才能与SST微绒毛的顶端相接触。然而，Bakst和Bauchan（2015）最近使用透射电镜在火鸡输卵管的微绒毛和排列于SST上皮細胞微绒毛顶部之间观察到了精子的头部。
还必须确认的是：上述作者所述的精子和SST上皮细胞之间的这种紧密排列是否能够由含碳水化合物的糖蛋白和/或糖脂介导、或者由于精子在SST中密实填充仅仅是并列排列（Tingari和Lake，1973）。有趣的是，Ashizawa和Nishiyama（1983）把鸡精液与来自输卵管不同区域的组织分离块共同培养，并记录下“……与来自其他区域的组织相比，观察到精子与SST上皮细胞紧密结合”。
因此，本研究的目的是鉴定与SST顶部表面相关联的碳水化合物成分。这些研究结果将可作为未来进一步研究SST管腔中精子/上皮细胞间互作的基础信息。此外，本研究还可了解与UVJ和SST上皮细胞相关联的碳水化合物成分的分布情况。
1 材料和方法
1.1 试验动物
试验采用罗斯308肉种鸡，按标准饲养条件饲养（Aviagen公司生产）；20周龄时转入蛋鸡笼，进行单笼饲养，鸡舍环境可控；21周起进行光照刺激（光周期为14 h光照∶10 h黑暗）。母鸡在24周龄时进行首次人工授精，此后每周进行一次人工授精，每次输入3亿个精子（3×108个）。每天收集种蛋并储存在 18 ℃的冷藏室中，每周孵化，照蛋检测种蛋的受精情况。本研究中，受精率在90%以上者设为高受精率个体，低于80%以下者为低受精率个体。
1.2 组织收集和组织学
母鸡在产蛋第6周（n=5）、第11周（n=4）、第14周（n=8）和第16周（n=7）后采用颈脱位法实施安乐死，随后将子宫和阴道作为一个整体分离。另一组6羽未产蛋母鸡同样在产蛋后第6周实施安乐死。去除包围子宫和阴道后端的结缔组织，露出UVJ，用立体显微镜定位SST（Bakst，1992）。从每羽母鸡中分离2～4块含有SST的UVJ黏膜样本，随后放入10%中性缓冲福尔马林（Neutral Buffered Formalin，NBF）中固定。
经过24 h～48 h的固定后，样品转移到浓度为70%（V/V）的乙醇溶液中，每30 min更换一次乙醇，共更换2次，然后转移到自动化系统的组织处理器中，最后用石蜡包埋。每个样本切4～6个切片、每片厚4 μm，并依次收集到载玻片上，置于37 ℃的暖托盘中风干，在室温条件下储存直到切片染色。染色包括苏木精和曙红（H
目前，对于调节精子在SST中储存和从中释放的细胞学和分子学机理几乎一无所知。本研究的目的是利用外源凝集素鉴定与SST上皮细胞表面相关联的复合糖。
本研究使用了6～16周产蛋上有较高和较低受精率的未产蛋母鸡和产蛋母鸡。含SST的UVJ黏膜切片用荧光共轭凝集素染色，通过共聚焦显微镜镜检。与UVJ和SST上皮细胞有关的一部分碳水化合物在它们的凝集素结合模式上存在差异。
未产蛋母鸡、幼龄母鸡和老年鸡在这两种上皮细胞内的凝集素结合模式上有明显差异，高受精率和低受精率的母鸡则存在微小差异。仅对半乳糖和N-乙酰半乳糖胺成分有特异性的外源凝集素位于SST腔表面。
虽然储存下来的精子可能被非常紧密地排列在SST上皮细胞顶端微绒毛上，但精子通过与复合糖相关的终端碳水化合物结合到微绒毛上，似乎并不是其延长储存时间的必要条件。
然而，SST上皮细胞与储存精子通过蜕落的微绒毛囊泡（其特征为表面含有终端半乳糖的复合糖和N-乙酰半乳糖胺成分）进行信息交流的可能性目前正在研究。
关键词：输卵管；精子储存；肉种鸡；复合糖
中图分类号：S814 文献标识码：C 文章编号：1001-0769（2017）02-0022-07
雌性家禽在自然交配或人工授精之后能够较长时间使精子保持活力。授精后，精子在阴道内会经历强烈的选择过程。被选中的精子群会被运输到近卵巢方向的子宫阴道接合部（Utero-vaginal Junction，UVJ），随后精子进入上皮细胞离散的管状内陷部——精子储存管（Sperm-storage Tubules，SST）中。
在随后的数天或数周中，储存在SST中的精子被逐步从SST中释放出来，上行至输卵管前端，并与随后排出的卵相互作用完成受精。Bakst（1993；2011）、Das等（2008）和Froman等（2003）对SST上皮细胞及其周围疏松结缔组织细胞以及相对于SST中的和从SST释放出储存精子的精子行为的可能作用分别进行了综述。
在哺乳动物中，复合糖通过选择性地将精子结合到输卵管峡部上皮细胞的顶部表面而使其成为构建精子储存库所必需的部分[参见Suarez（2008）、Talevi和Gualtieri（2010）的综述]。
Ignotz等（2001）介绍了精子贮库的三大功能：通过只允许相对较少的精子在排卵期到达受精的部位以减少多精入卵的可能性；维持精子在精子输送到雌性动物体内至排卵这段时间内的精子活力和受精力；促进精子获能并获得极大的活力。
与鸡精子质膜相关联的复合糖参与阴道中的精子选择、精子通过阴道向子宫阴道接合部的近子宫运输（Froman和Engel，1989；Steele和Wishart，1996）及精子与内部卵黄周围层间的相互作用。邻近SST上皮细胞的鸡精子呈紧密排列（Tingari和Lake，1973）或与SST上皮细胞相结合（Ahammad等，2011）的状态。
Schuppin等（1984）认为，只有当火鸡的SST腔内充满了精子时，它们才能与SST微绒毛的顶端相接触。然而，Bakst和Bauchan（2015）最近使用透射电镜在火鸡输卵管的微绒毛和排列于SST上皮細胞微绒毛顶部之间观察到了精子的头部。
还必须确认的是：上述作者所述的精子和SST上皮细胞之间的这种紧密排列是否能够由含碳水化合物的糖蛋白和/或糖脂介导、或者由于精子在SST中密实填充仅仅是并列排列（Tingari和Lake，1973）。有趣的是，Ashizawa和Nishiyama（1983）把鸡精液与来自输卵管不同区域的组织分离块共同培养，并记录下“……与来自其他区域的组织相比，观察到精子与SST上皮细胞紧密结合”。
因此，本研究的目的是鉴定与SST顶部表面相关联的碳水化合物成分。这些研究结果将可作为未来进一步研究SST管腔中精子/上皮细胞间互作的基础信息。此外，本研究还可了解与UVJ和SST上皮细胞相关联的碳水化合物成分的分布情况。
1 材料和方法
1.1 试验动物
试验采用罗斯308肉种鸡，按标准饲养条件饲养（Aviagen公司生产）；20周龄时转入蛋鸡笼，进行单笼饲养，鸡舍环境可控；21周起进行光照刺激（光周期为14 h光照∶10 h黑暗）。母鸡在24周龄时进行首次人工授精，此后每周进行一次人工授精，每次输入3亿个精子（3×108个）。每天收集种蛋并储存在 18 ℃的冷藏室中，每周孵化，照蛋检测种蛋的受精情况。本研究中，受精率在90%以上者设为高受精率个体，低于80%以下者为低受精率个体。
1.2 组织收集和组织学
母鸡在产蛋第6周（n=5）、第11周（n=4）、第14周（n=8）和第16周（n=7）后采用颈脱位法实施安乐死，随后将子宫和阴道作为一个整体分离。另一组6羽未产蛋母鸡同样在产蛋后第6周实施安乐死。去除包围子宫和阴道后端的结缔组织，露出UVJ，用立体显微镜定位SST（Bakst，1992）。从每羽母鸡中分离2～4块含有SST的UVJ黏膜样本，随后放入10%中性缓冲福尔马林（Neutral Buffered Formalin，NBF）中固定。
经过24 h～48 h的固定后，样品转移到浓度为70%（V/V）的乙醇溶液中，每30 min更换一次乙醇，共更换2次，然后转移到自动化系统的组织处理器中，最后用石蜡包埋。每个样本切4～6个切片、每片厚4 μm，并依次收集到载玻片上，置于37 ℃的暖托盘中风干，在室温条件下储存直到切片染色。染色包括苏木精和曙红（H