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摘要：利用PCR-RFLP技术，检测101头长白猪NCOA-1基因多态性，并分析其与繁殖性状的关系。结果表明，NCOA-1基因AA、AB、BB基因型频率分别为0.500、0.335、0.165；NCOA-1基因中BB型在窝产仔数和窝产仔活数、初生窝重和断奶窝重与AA型、AB型有显著性差异（P<0.05）。
关键词：长白猪；NCOA-1；繁殖；性能
中图分类号： S828.3文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）09-0175-03
收稿日期：2013-11-20
基金项目：国家自然科学基金（编号：30901014，31060295）。
作者简介：鲁慧文（1987—），男，黑龙江绥化人，硕士，研究方向为农业推广（养殖）。E-mail：lhw0417@126.com。
通信作者：黄涛，副教授，从事猪分子遗传育种研究。E-mail：taohuang100@sina.com。猪的繁殖性能是一类重要的经济性状，其好坏直接影响猪场的经济效益。繁殖性能属于限性表达的低遗传力性状，运用常规的育种方法对该类性状进行改良进展缓慢，从分子水平上寻找控制猪产仔数的主基因并应用到育种实践中成为可能。核受体/类固醇辅激活因子1（NCOA-1/SRC-1）是p160类固醇受体辅激活因子（SRC）家族中的一员，有研究表明，SRC家族在发育、体生长、类固醇激素应答、新陈代谢、繁殖、心血管系统和炎性反应中有独特的生物学功能[1-2]。NCOA-1作为转录辅助激活因子，是第1个被发现的类固醇受体[3]，核受体辅助活化因子1（NCOA-1）是细胞核激素受体的辅助激活剂，这些受体有雌性激素、孕酮受体和某些其他转录因子如Ets-2和PEA3[4]。NCOA-1敲除的小鼠展现正常的发育能力和体躯生长，但显示部分激素抑制类固醇和甲状腺激素、延迟浦肯野细胞的发育、降低雌激素依赖的血管保护、出现多种代谢异常[5-9]。另有研究发现，NCOA-1表达异常是引起乳腺癌的诱因[4，10]。
NCOA-1是猪繁殖性状候选基因，研究表明，其多态性与猪的产仔数可能有关联，定位于猪3号染色体上，猪的NCOA-1基因总共有97 681 bp，含有19个外显子，其cDNA长度为4 451 bp。核受体辅激活蛋白通过与结合到DNA上的核受体相互作用并增强转录活性[11]，受到影响的雄激素受体、雌激素受体等在动物的生长发育和繁殖等生理过程起到重要作用[12]。NCOA-1蛋白不仅增强了雌激素受体的活性，而且反过来刺激特定的雌激素反应基因的转录，调节随后的生理反应[13]。国外学者已经对NCOA-1基因与猪多产性的相关性进行研究，将其定位于SSC3，称其是繁殖性状的“开关”[14]。NCOA-1基因在对不同品种或不同地区母猪群体研究得到的结果不尽相同，本研究拟分析NCOA-1基因对新疆地区长白猪繁殖力性状的遗传效应，为该候选基因的选种应用积累数据，以期为分子标记辅助选择育种提供依据。
1材料与方法
1.1试验材料
试验猪均来自新疆农八师142团猪场，用随机抽样法选择有完整繁殖性状记录的长白母猪101头进行活体采样，同时收集试验母猪的窝产仔数、窝产活仔数、胎次、初生窝重和断奶窝重等资料。
1.2主要仪器和试剂
主要仪器：RT-PCR仪、DYY-4稳流稳压电泳仪、恒温水浴锅、台式恒温振荡器、电泳凝胶成像系统、微波炉、台式高速离心机；主要试剂：Taq DNA聚合酶、蛋白酶K及DNA限制性内切酶RsaⅠ，均购自TaKaRa。
1.3试验方法
1.3.1基因组DNA的提取采用酚-氯仿常规提取法提取基因组DNA。
1.3.2引物的设计与合成根据猪NCOA-1基因序列设计引物，由上海生工生物有限公司合成。引物序列为：F-5′-AGGGGCTACCCTCCTGTAAG-3′；R-5′-CTTCTCTGCCAGTTCTCCAGTC-3′。
1.3.3PCR扩增PCR反应总体系为25 μL，包括：10×buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，50 ng/μL模板DNA 0.8 μL，Taq酶0.3 uL，MgCl2 3 μL，ddH2O 15.4 μL。反应条件为：94 ℃变性4 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s 35次循环；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。
1.3.4NCOA-1基因扩增产物的酶切8.5 μL PCR产物加入0.5 μL RsaⅠ及1 μL buffer，37 ℃水浴3 h，酶切产物用15%的琼脂糖电泳检测分型。
1.3.5数据处理采用Excel和SPSS软件分析数据，并参考徐迎宁等的处理模型[15]。基因型数据：NCOA-1、AA、AB、BB；繁殖性状：窝产仔数、窝产活仔数、初生窝重、断奶窝重；模型（基因的独立效应模型）：yi=μ+αi+ei，其中，yi为性状值，μ为总体平均数，αi为基因型效应值（i=AA、AB、BB），ei为随机误差。
2结果与分析
2.1NCOA-1基因扩增结果
NCOA-1基因PCR扩增后经1.5%琼脂糖凝胶电泳，检测到1条长约408 bp的清晰条带（图1）。
2.2PCR扩增产物酶切结果
由图2可见，各基因型条带清晰。
2.3NCOA-1基因的基因频率和基因型频率
根据检测样品的基因型及检出总数，计算NCOA-1各基因型在长白猪群体中的频率和等位基因频率。由表1可知，NCOA-1基因的基因型频率是AA>AB>BB，优势基因型频率为AA，达到0.500；基因频率A>B。表1NCOA-1基因的基因频率和基因型频率 品种样本数
（头）基因型分布（头）基因型频率基因频率AAABBBAAABBBAB长白1015034170.500 00.335 00.165 00.667 50.332 5
2.4NCOA-1基因对猪基因效应的影响
由表2可见，在初产母猪中，NCOA-1各基因型之间窝产仔数差异显著（P<0.05），各基因型之间窝产活仔数差异显著（P<0.05），其中，AB基因型母猪的窝产仔数、窝产活仔数最多；在经产母猪中，NCOA-1各基因型之间窝产仔数差异显著（P<0.05），各基因型之间窝产活仔数差异显著（P<005），其中，AA基因型母猪的窝产仔数、窝产活仔数最多；在所有胎次中，NCOA-1各基因型之间窝产仔数和窝产活仔数差异均达到显著水平（P<0.05）；AA基因型的窝产仔数、窝产活仔数为最多。
由表3可见，初产母猪、经产母猪和所有胎次中，NCOA-1基因各基因型之间初生窝重和断奶窝重的差异均显著（P<0.05）；AA型母猪比AB、BB型母猪所产的初生窝重、断奶窝重都高。
3小结与讨论
通过NCOA-1分别对长白猪繁殖性状的统计分析，表明NCOA-1基因对长白猪窝产仔数、窝产活仔数、初生窝重、 断奶窝重等繁殖性状，无论在初产、经产还是所有胎次中都有显著影响。
核受体辅激活蛋白1（NCOA-1）基因的产物核受体辅激活蛋白与结合在DNA上的雌激素受体相互作用并加强其转录活性。施启顺等研究表明，NCOA-1基因RsaⅠ酶切多态性对母猪产仔性状有显著影响，在窝产仔数和窝产活仔数上都出现AA>AB>BB趋势，基因型间差异极显著（P<0.01）[16]，本研究结果和施启顺等报道基本一致。NCOA-1基因大部分AA和BB、AB和BB差异显著，如该基因TNB加性效应为0.33，NBA加性效应为1.38，与Melville等报道结果[17]基本一致。总之，试验结果表明，NCOA-1中AA为优势基因，这可以为今后的生产研究提供良好的选择方向。
参考文献：
[1]Xu J M，Li Q T. Review of the in vivo functions of the p160 steroid receptor coactivator family[J]. Molecular Endocrinology，2003，17（9）：1681-1692.
[2]Yu C D，York B，Wang S，et al. An essential function of the SRC-3 coactivator in suppression of cytokine mRNA translation and inflammatory response[J]. Molecular Cell，2007，25（5）：765-778.
[3] Oate S A，Tsai S Y，Tsai M J，et al. Sequence and characterization of a coactivator for the steroid hormone receptor superfamily[J]. Science，1995，270（5240）：1354-1357.
[4] Wang S，Yuan Y H，Liao L，et al. Disruption of the SRC-1 gene in mice suppresses breast cancer metastasis without affecting primary tumor formation[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2009，106 （1）：151-156.
[5] Weiss R E，Xu J，Ning G，et al. Mice deficient in the steroid receptor coactivator 1（SRC-1） are resistant to thyroid hormone[J]. The EMBO Journal，1999，18（7）：1900-1904..
[6]Xu J M，Qiu Y H，Demayo F J，et al. Partial hormone resistance in mice with disruption of the steroid receptor coactivator-1 （SRC-1） gene[J]. Science，1998，279（5358）：1922-1925.
[7]Nishihara E，Yoshida-Komiya H，Chan C S，et al. SRC-1 null mice exhibit moderate motor dysfunction and delayed development of cerebellar purkinje cells[J]. The Journal of Neuroscience，2003，23（1）：213-222.
[8]Yuan Y H，Xu J M. Loss-of-function deletion of the steroid receptor coactivator-1 gene in mice reduces estrogen effect on the vascular injury response[J]. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology，2007，27（7）：1521-1527. [9]Picard F，Géhin M，Annicotte J，et al. SRC-1 and TIF2 control energy balance between white and brown adipose tissues[J]. Cell，2002，111（7）：931-941.
[10]Qin L，Liao L，Redmond A，et al. The AIB1 oncogene promotes breast cancer metastasis by activation of PEA3-mediated matrix metalloproteinase 2（MMP2）and MMP9 expression[J]. Molecular and Cellular Biology，2008，28（19）：5937-5950.
[11]Kamei Y，Xu L，Heinzel T，et al. A CBP integrator complex mediates transcriptional activation and AP-1 inhibition by nuclear receptors[J]. Cell，1996，85（3）：403-414.
[12]Glass C K. Differential recognition of target genes by nuclear receptor monomers，dimers and heterodimers[J]. Endocrine Reviews，1994，15（3）：391-407.
[13]Hanstein B，Eckner R，Direnzoh J. P300 is a component of an estrogen receptor coactivator complex[J]. Proc Nati Acad Sci USA，1996，93（21）：11540-11545.
[14]Razeto A，Ramakrishnan V，Litterst C M，et al. Structure of the NCOA-1/SRC-1 PAS-B domain bound to the LXXLL motif of the STAT6 transactivation domain[J]. Journal of Molecular Biology，2004，336（2）：319-329.
[15]徐宁迎，章胜乔，彭淑红. 金华猪3个繁殖性状主基因的分布及其效应的研究[J]. 遗传学报，2003，30（12）：1090-1096.
[16]施启顺，柳小春，刘志伟，等. 5个与猪产仔数相关基因的效应分析[J]. 遗传，2006，28（6）：652-658.
[17]Melville J S，Gibbin A M，Robinson J A，et al. Meishang positire QTL for prolificacy traits found at the NCOA1 locus on SSC3[C]. Proceedings of the 7th World Congress on Genetics Applied to Livestock Production.Montpellier，France，2002：19-23.华利忠，吴文开，邵国青. 发酵床与传统水冲圈模式下猪瘟、蓝耳病及口蹄疫血清抗体差异调查[J]. 江苏农业科学，2014，42（9）：178-180.
关键词：长白猪；NCOA-1；繁殖；性能
中图分类号： S828.3文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）09-0175-03
收稿日期：2013-11-20
基金项目：国家自然科学基金（编号：30901014，31060295）。
作者简介：鲁慧文（1987—），男，黑龙江绥化人，硕士，研究方向为农业推广（养殖）。E-mail：lhw0417@126.com。
通信作者：黄涛，副教授，从事猪分子遗传育种研究。E-mail：taohuang100@sina.com。猪的繁殖性能是一类重要的经济性状，其好坏直接影响猪场的经济效益。繁殖性能属于限性表达的低遗传力性状，运用常规的育种方法对该类性状进行改良进展缓慢，从分子水平上寻找控制猪产仔数的主基因并应用到育种实践中成为可能。核受体/类固醇辅激活因子1（NCOA-1/SRC-1）是p160类固醇受体辅激活因子（SRC）家族中的一员，有研究表明，SRC家族在发育、体生长、类固醇激素应答、新陈代谢、繁殖、心血管系统和炎性反应中有独特的生物学功能[1-2]。NCOA-1作为转录辅助激活因子，是第1个被发现的类固醇受体[3]，核受体辅助活化因子1（NCOA-1）是细胞核激素受体的辅助激活剂，这些受体有雌性激素、孕酮受体和某些其他转录因子如Ets-2和PEA3[4]。NCOA-1敲除的小鼠展现正常的发育能力和体躯生长，但显示部分激素抑制类固醇和甲状腺激素、延迟浦肯野细胞的发育、降低雌激素依赖的血管保护、出现多种代谢异常[5-9]。另有研究发现，NCOA-1表达异常是引起乳腺癌的诱因[4，10]。
NCOA-1是猪繁殖性状候选基因，研究表明，其多态性与猪的产仔数可能有关联，定位于猪3号染色体上，猪的NCOA-1基因总共有97 681 bp，含有19个外显子，其cDNA长度为4 451 bp。核受体辅激活蛋白通过与结合到DNA上的核受体相互作用并增强转录活性[11]，受到影响的雄激素受体、雌激素受体等在动物的生长发育和繁殖等生理过程起到重要作用[12]。NCOA-1蛋白不仅增强了雌激素受体的活性，而且反过来刺激特定的雌激素反应基因的转录，调节随后的生理反应[13]。国外学者已经对NCOA-1基因与猪多产性的相关性进行研究，将其定位于SSC3，称其是繁殖性状的“开关”[14]。NCOA-1基因在对不同品种或不同地区母猪群体研究得到的结果不尽相同，本研究拟分析NCOA-1基因对新疆地区长白猪繁殖力性状的遗传效应，为该候选基因的选种应用积累数据，以期为分子标记辅助选择育种提供依据。
1材料与方法
1.1试验材料
试验猪均来自新疆农八师142团猪场，用随机抽样法选择有完整繁殖性状记录的长白母猪101头进行活体采样，同时收集试验母猪的窝产仔数、窝产活仔数、胎次、初生窝重和断奶窝重等资料。
1.2主要仪器和试剂
主要仪器：RT-PCR仪、DYY-4稳流稳压电泳仪、恒温水浴锅、台式恒温振荡器、电泳凝胶成像系统、微波炉、台式高速离心机；主要试剂：Taq DNA聚合酶、蛋白酶K及DNA限制性内切酶RsaⅠ，均购自TaKaRa。
1.3试验方法
1.3.1基因组DNA的提取采用酚-氯仿常规提取法提取基因组DNA。
1.3.2引物的设计与合成根据猪NCOA-1基因序列设计引物，由上海生工生物有限公司合成。引物序列为：F-5′-AGGGGCTACCCTCCTGTAAG-3′；R-5′-CTTCTCTGCCAGTTCTCCAGTC-3′。
1.3.3PCR扩增PCR反应总体系为25 μL，包括：10×buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，50 ng/μL模板DNA 0.8 μL，Taq酶0.3 uL，MgCl2 3 μL，ddH2O 15.4 μL。反应条件为：94 ℃变性4 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s 35次循环；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。
1.3.4NCOA-1基因扩增产物的酶切8.5 μL PCR产物加入0.5 μL RsaⅠ及1 μL buffer，37 ℃水浴3 h，酶切产物用15%的琼脂糖电泳检测分型。
1.3.5数据处理采用Excel和SPSS软件分析数据，并参考徐迎宁等的处理模型[15]。基因型数据：NCOA-1、AA、AB、BB；繁殖性状：窝产仔数、窝产活仔数、初生窝重、断奶窝重；模型（基因的独立效应模型）：yi=μ+αi+ei，其中，yi为性状值，μ为总体平均数，αi为基因型效应值（i=AA、AB、BB），ei为随机误差。
2结果与分析
2.1NCOA-1基因扩增结果
NCOA-1基因PCR扩增后经1.5%琼脂糖凝胶电泳，检测到1条长约408 bp的清晰条带（图1）。
2.2PCR扩增产物酶切结果
由图2可见，各基因型条带清晰。
2.3NCOA-1基因的基因频率和基因型频率
根据检测样品的基因型及检出总数，计算NCOA-1各基因型在长白猪群体中的频率和等位基因频率。由表1可知，NCOA-1基因的基因型频率是AA>AB>BB，优势基因型频率为AA，达到0.500；基因频率A>B。表1NCOA-1基因的基因频率和基因型频率 品种样本数
（头）基因型分布（头）基因型频率基因频率AAABBBAAABBBAB长白1015034170.500 00.335 00.165 00.667 50.332 5
2.4NCOA-1基因对猪基因效应的影响
由表2可见，在初产母猪中，NCOA-1各基因型之间窝产仔数差异显著（P<0.05），各基因型之间窝产活仔数差异显著（P<0.05），其中，AB基因型母猪的窝产仔数、窝产活仔数最多；在经产母猪中，NCOA-1各基因型之间窝产仔数差异显著（P<0.05），各基因型之间窝产活仔数差异显著（P<005），其中，AA基因型母猪的窝产仔数、窝产活仔数最多；在所有胎次中，NCOA-1各基因型之间窝产仔数和窝产活仔数差异均达到显著水平（P<0.05）；AA基因型的窝产仔数、窝产活仔数为最多。
由表3可见，初产母猪、经产母猪和所有胎次中，NCOA-1基因各基因型之间初生窝重和断奶窝重的差异均显著（P<0.05）；AA型母猪比AB、BB型母猪所产的初生窝重、断奶窝重都高。
3小结与讨论
通过NCOA-1分别对长白猪繁殖性状的统计分析，表明NCOA-1基因对长白猪窝产仔数、窝产活仔数、初生窝重、 断奶窝重等繁殖性状，无论在初产、经产还是所有胎次中都有显著影响。
核受体辅激活蛋白1（NCOA-1）基因的产物核受体辅激活蛋白与结合在DNA上的雌激素受体相互作用并加强其转录活性。施启顺等研究表明，NCOA-1基因RsaⅠ酶切多态性对母猪产仔性状有显著影响，在窝产仔数和窝产活仔数上都出现AA>AB>BB趋势，基因型间差异极显著（P<0.01）[16]，本研究结果和施启顺等报道基本一致。NCOA-1基因大部分AA和BB、AB和BB差异显著，如该基因TNB加性效应为0.33，NBA加性效应为1.38，与Melville等报道结果[17]基本一致。总之，试验结果表明，NCOA-1中AA为优势基因，这可以为今后的生产研究提供良好的选择方向。
参考文献：
[1]Xu J M，Li Q T. Review of the in vivo functions of the p160 steroid receptor coactivator family[J]. Molecular Endocrinology，2003，17（9）：1681-1692.
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[7]Nishihara E，Yoshida-Komiya H，Chan C S，et al. SRC-1 null mice exhibit moderate motor dysfunction and delayed development of cerebellar purkinje cells[J]. The Journal of Neuroscience，2003，23（1）：213-222.
[8]Yuan Y H，Xu J M. Loss-of-function deletion of the steroid receptor coactivator-1 gene in mice reduces estrogen effect on the vascular injury response[J]. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology，2007，27（7）：1521-1527. [9]Picard F，Géhin M，Annicotte J，et al. SRC-1 and TIF2 control energy balance between white and brown adipose tissues[J]. Cell，2002，111（7）：931-941.
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[11]Kamei Y，Xu L，Heinzel T，et al. A CBP integrator complex mediates transcriptional activation and AP-1 inhibition by nuclear receptors[J]. Cell，1996，85（3）：403-414.
[12]Glass C K. Differential recognition of target genes by nuclear receptor monomers，dimers and heterodimers[J]. Endocrine Reviews，1994，15（3）：391-407.
[13]Hanstein B，Eckner R，Direnzoh J. P300 is a component of an estrogen receptor coactivator complex[J]. Proc Nati Acad Sci USA，1996，93（21）：11540-11545.
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[15]徐宁迎，章胜乔，彭淑红. 金华猪3个繁殖性状主基因的分布及其效应的研究[J]. 遗传学报，2003，30（12）：1090-1096.
[16]施启顺，柳小春，刘志伟，等. 5个与猪产仔数相关基因的效应分析[J]. 遗传，2006，28（6）：652-658.
[17]Melville J S，Gibbin A M，Robinson J A，et al. Meishang positire QTL for prolificacy traits found at the NCOA1 locus on SSC3[C]. Proceedings of the 7th World Congress on Genetics Applied to Livestock Production.Montpellier，France，2002：19-23.华利忠，吴文开，邵国青. 发酵床与传统水冲圈模式下猪瘟、蓝耳病及口蹄疫血清抗体差异调查[J]. 江苏农业科学，2014，42（9）：178-180.