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【摘要】 背景與目的 肝癌（hepatic carcinoma）是我国常见恶性肿瘤之一，死亡率高，在恶性肿瘤死亡顺位中仅次于胃癌、食道癌而居第三位。本研究将探索性地研究Frizzled-9在所有的肝细胞癌中都有表达，并且表达多少与肝癌的扩散及侵袭相关，而且，干扰了肝癌细胞FZ9后，通过Transwell小室模型检测被剔除了FZ9基因HepG-2细胞移动能力，为探寻治疗胰腺癌的新策略提供思路。方法 应用RT-PCR方法检测肝癌细胞株HepG-2的FZ9的表达情况。并应用脂质体基因转染技术转染FZ9-siRNA至肝癌细胞株HepG-2。通过Transwell小室模型分析肝癌细胞的移动、侵袭性。结果 Frizzled-9特异的siRNA明显抑制HepG-2细胞中FZ9及蛋白的表达，与对照组比较其抑制率为97.6%。转染Frizzled-9-siRNA（5nM）24小时后对肝癌细胞的转移及侵袭能力有显著影响（P〈0.05），实验组较空白组转移及侵袭能力减弱。
【关键词】 Frizzled-9；RNA干扰（RNAi）；肝癌；细胞侵袭
doi：10.3969/j.issn.1004-7484（s）.2013.08.063 文章编号：1004-7484（2013）-08-4170-01
1 实验方法
1.1 细胞培养 用RPMI1640完全培养基培养细胞。待细胞进入对数生长期，即可用于下一步实验。
1.1.1 siRNA转染细胞 采用Hiperfect Transfection Reagent介导的脂质体转染技术。参阅其产品说明书进行转染，实验分4组：空白对照组：HepG-2常规培养，不予干预，阴性对照组：转染通用对照shRNA（HK）或转染带有荧光标记的对照siRNA，以监测转染效，阳性对照组：转染GAPDH siRN，实验组。转染Frizzled-9 siRNA1）转染前24小时接种HepG-2细胞于6孔板，使细胞在24小时后融合。37℃，5%CO2培养细胞24小时，取1.5ml EP管将150mgsiRNA（20uM siRNA 3.3ul）溶于85ul 1640/DMEM，加入Hiperfect Transfection Reagent 12ul，使总体积为100ul，颠倒混匀，室温下放置10min，形成转染复合物。使用37℃CPBS冲洗细胞两遍，将转染转复合物加入相应的孔后，混匀。放入37℃，5%CO2培养细胞。24小时后弃去含转染复合物的培养基，用37℃CPBS冲洗细胞两遍用于后续实验。
1.2 trans-well转移小室模型测定Frizzled-9对胰腺癌细胞侵袭能力的影响 用70%酒精处理无菌镊子，用镊子装置好小室，小室放入培养板中，在上室加入300μl预温的无血清培养基，室温下静置1小时，使基质胶再水化。再吸去剩余培养液，消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1-2遍，下腔室中加入500ul含有20%FBS条件培养基，取上述细胞悬液300μl加入Transwell小室培养细胞：常规培养24小时，棉头拭子擦去基质和上方的细胞，加入500ul细胞染液（试剂盒配带）于24孔板中，将小室放入浸泡20min，将下表面的细胞染色，将小室放入蒸馏水中洗去其它染液，空气晾干，显微镜下直接观察穿过膜的细胞数，随机计数10个视野，计数每个视野内穿过微孔的细胞数，以侵袭细胞的相对数目来表示肿瘤细胞的侵袭能力。
2 实验结果
Transwell侵袭小室模型测定细胞体外侵袭能力谢宏民根据前述细胞计数法，在普通显微镜下观察细胞数，见图1。
3 讨 论
（Fz）是一种细胞表面受体，它可与介导细胞移动的Wnt配体相结合，有10个同源基因[1-2]，Fz9在大脑和骨骼肌表现最为明显，抑制其表达可引起肌肉骨骼异常和神经系统问题，比如Williams综合症[3]。人类胶质母细胞瘤的Fz9表达高于正常的大脑组织细胞[4]。增加Fz9的表达可增强星形细胞瘤和胶质母细胞瘤的致癌作用及促进癌细胞生长。
有研究表明，Fz9表达在所有的肝癌细胞中，并且Fz9参与肝癌的发生与发展。而Fz9正常情况下不表达于胎儿和成人肝，通过RNAi介导FZ9基因沉默后，通过MTS分析可导致肝癌细胞的移动能力下降，而通过免疫印迹方法检测到被Fz9-siRNA转染的细胞，可下调细胞周期蛋白D1，而后者是Wnt途径中的关键因子[5]。这表明Fz9抑制细胞增殖通过细胞周期，而不是通过细胞凋亡。所以Fz9被认为与肝脏肿瘤转移及侵袭相关。
本实验为明确证实本研究中所用的FZ9-siRNA能有效沉默FZ9基因。本研究从mRNA水平证实转染si-RNA对FZ9基因表达的影响。不仅证实Fz9存在于肝癌细胞HepG-2中，并且通过RNAi介导的FZ9基因沉默，抑制了肝癌细胞株HepG-2的FZ9表达，通过Transwell小室模型检测被剔除了FZ9基因HepG-2细胞移动能力，结果显示转染组与空白对照组有统计学差异，表明FZ9基因可以促进肿瘤细胞的侵袭，本实验研究结果与Tatsuya[6]等人的研究相似。因为Fz9-siRNA不会影响周围正常肝组织，所以Fz9-siRNA基因沉默有应用于临床的可能，为肝癌的基因治疗提供实验依据。
总之，本研究证明了Fz9是肝癌细胞的侵袭与转移的一个重要因素，与肝癌的发生、发展密切相关。Fz9基因可以作为一个靶基因治疗原发性肝癌。
参考文献
[1] Bhanot P，Brink M，Samos CH，et al.A new member of the frizzled family from Drosophila functions as a Wingless receptor.Nature，1996，382：225-230.
[2] Wang HY，Liu T and Malbon CC.Structure-function analysis of Frizzleds.Cell Signal，200618：934-941.
[3] Wang YK，Sporle R，Paperna T，Schughart K and Francke U.Characterization and expression pattern of the frizzled gene Fzd9，the mouse homolog of FZD9 which is deleted in Williams-Beuren syndrome.Genomics，199957：235-248.
[4] Zhang Z，Schittenhelm J，Guo K，et al.Upregulation of frizzled 9 in astrocytomas.Neuropathol Appl Neurobiol，200632：615-624.
[5] Tatsuya F，Minoru T.SiRNA of Frizzled-9 suppresses proliferation and motility of hepatoma cells，Oncology，200935：861-866.
[6] Nusse R.Wnt signaling and stem cell control.Cell Res，200818：523-527.
【关键词】 Frizzled-9；RNA干扰（RNAi）；肝癌；细胞侵袭
doi：10.3969/j.issn.1004-7484（s）.2013.08.063 文章编号：1004-7484（2013）-08-4170-01
1 实验方法
1.1 细胞培养 用RPMI1640完全培养基培养细胞。待细胞进入对数生长期，即可用于下一步实验。
1.1.1 siRNA转染细胞 采用Hiperfect Transfection Reagent介导的脂质体转染技术。参阅其产品说明书进行转染，实验分4组：空白对照组：HepG-2常规培养，不予干预，阴性对照组：转染通用对照shRNA（HK）或转染带有荧光标记的对照siRNA，以监测转染效，阳性对照组：转染GAPDH siRN，实验组。转染Frizzled-9 siRNA1）转染前24小时接种HepG-2细胞于6孔板，使细胞在24小时后融合。37℃，5%CO2培养细胞24小时，取1.5ml EP管将150mgsiRNA（20uM siRNA 3.3ul）溶于85ul 1640/DMEM，加入Hiperfect Transfection Reagent 12ul，使总体积为100ul，颠倒混匀，室温下放置10min，形成转染复合物。使用37℃CPBS冲洗细胞两遍，将转染转复合物加入相应的孔后，混匀。放入37℃，5%CO2培养细胞。24小时后弃去含转染复合物的培养基，用37℃CPBS冲洗细胞两遍用于后续实验。
1.2 trans-well转移小室模型测定Frizzled-9对胰腺癌细胞侵袭能力的影响 用70%酒精处理无菌镊子，用镊子装置好小室，小室放入培养板中，在上室加入300μl预温的无血清培养基，室温下静置1小时，使基质胶再水化。再吸去剩余培养液，消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1-2遍，下腔室中加入500ul含有20%FBS条件培养基，取上述细胞悬液300μl加入Transwell小室培养细胞：常规培养24小时，棉头拭子擦去基质和上方的细胞，加入500ul细胞染液（试剂盒配带）于24孔板中，将小室放入浸泡20min，将下表面的细胞染色，将小室放入蒸馏水中洗去其它染液，空气晾干，显微镜下直接观察穿过膜的细胞数，随机计数10个视野，计数每个视野内穿过微孔的细胞数，以侵袭细胞的相对数目来表示肿瘤细胞的侵袭能力。
2 实验结果
Transwell侵袭小室模型测定细胞体外侵袭能力谢宏民根据前述细胞计数法，在普通显微镜下观察细胞数，见图1。
3 讨 论
（Fz）是一种细胞表面受体，它可与介导细胞移动的Wnt配体相结合，有10个同源基因[1-2]，Fz9在大脑和骨骼肌表现最为明显，抑制其表达可引起肌肉骨骼异常和神经系统问题，比如Williams综合症[3]。人类胶质母细胞瘤的Fz9表达高于正常的大脑组织细胞[4]。增加Fz9的表达可增强星形细胞瘤和胶质母细胞瘤的致癌作用及促进癌细胞生长。
有研究表明，Fz9表达在所有的肝癌细胞中，并且Fz9参与肝癌的发生与发展。而Fz9正常情况下不表达于胎儿和成人肝，通过RNAi介导FZ9基因沉默后，通过MTS分析可导致肝癌细胞的移动能力下降，而通过免疫印迹方法检测到被Fz9-siRNA转染的细胞，可下调细胞周期蛋白D1，而后者是Wnt途径中的关键因子[5]。这表明Fz9抑制细胞增殖通过细胞周期，而不是通过细胞凋亡。所以Fz9被认为与肝脏肿瘤转移及侵袭相关。
本实验为明确证实本研究中所用的FZ9-siRNA能有效沉默FZ9基因。本研究从mRNA水平证实转染si-RNA对FZ9基因表达的影响。不仅证实Fz9存在于肝癌细胞HepG-2中，并且通过RNAi介导的FZ9基因沉默，抑制了肝癌细胞株HepG-2的FZ9表达，通过Transwell小室模型检测被剔除了FZ9基因HepG-2细胞移动能力，结果显示转染组与空白对照组有统计学差异，表明FZ9基因可以促进肿瘤细胞的侵袭，本实验研究结果与Tatsuya[6]等人的研究相似。因为Fz9-siRNA不会影响周围正常肝组织，所以Fz9-siRNA基因沉默有应用于临床的可能，为肝癌的基因治疗提供实验依据。
总之，本研究证明了Fz9是肝癌细胞的侵袭与转移的一个重要因素，与肝癌的发生、发展密切相关。Fz9基因可以作为一个靶基因治疗原发性肝癌。
参考文献
[1] Bhanot P，Brink M，Samos CH，et al.A new member of the frizzled family from Drosophila functions as a Wingless receptor.Nature，1996，382：225-230.
[2] Wang HY，Liu T and Malbon CC.Structure-function analysis of Frizzleds.Cell Signal，200618：934-941.
[3] Wang YK，Sporle R，Paperna T，Schughart K and Francke U.Characterization and expression pattern of the frizzled gene Fzd9，the mouse homolog of FZD9 which is deleted in Williams-Beuren syndrome.Genomics，199957：235-248.
[4] Zhang Z，Schittenhelm J，Guo K，et al.Upregulation of frizzled 9 in astrocytomas.Neuropathol Appl Neurobiol，200632：615-624.
[5] Tatsuya F，Minoru T.SiRNA of Frizzled-9 suppresses proliferation and motility of hepatoma cells，Oncology，200935：861-866.
[6] Nusse R.Wnt signaling and stem cell control.Cell Res，200818：523-527.