【摘 要】
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目的 构建大肠埃希菌(Escherichia coli)嘌呤核苷磷酸化酶(purine nucleoside phosphorylase,PNP)基因表达载体,研究其生物活性,为肿瘤的基因治疗奠定基础.方法 PCR扩增大肠
【机 构】
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南昌大学医学院病理生理学教研室,宁波市第二医院普外科,江西省医学科学研究所医学生物高技术重点实验室,南昌大学医学院组织胚胎学教研室
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目的 构建大肠埃希菌(Escherichia coli)嘌呤核苷磷酸化酶(purine nucleoside phosphorylase,PNP)基因表达载体,研究其生物活性,为肿瘤的基因治疗奠定基础.方法 PCR扩增大肠埃希菌K12的PNP基因,T4连接酶将PNP连接入pMSCV逆转录病毒载体,构建重组逆转录病毒载体pMSCV/PNP.pMSCV/PNP转化感受态大肠埃希菌XL1-Blue,提取pMSCV/PNP,酶切、PCR和测序鉴定.病毒包装细胞293产生重组逆转录病毒pMSCV/PNP,流式细胞仪测病毒滴度.pMSCV/PNP转染胰腺癌细胞BXPC-3,倒置荧光显微镜观察,FACS分离转染阳性细胞(GFP阳性).RT-PCR检测PNP mRNA在胰腺癌细胞BXPC-3 细胞中的表达,MTT法检测PNP基因的生物活性.结果 PCR扩增出大肠埃希菌PNP基因(738 bp),酶切和PCR的电泳条带显示pMSCV/PNP,测序结果正常.293包装细胞产生高滴度(3.6×107 U/ml)重组逆转录病毒pMSCV/PNP.RT-PCR实验结果表明,pMSCV/PNP转染的胰腺癌细胞BXPC-3表达PNP mRNA.前药6-甲基嘌呤-2′-脱氧核苷(MePdR)作用72 h 浓度达1.00 mg/L,BXPC-3/PNP细胞存活率为10.09 %,随着MePdR浓度加大,BXPC-3/PNP细胞存活率继续下降直至为0.结论 构建了pMSCV/PNP载体,获得了表达大肠埃希菌PNP基因的BXPC-3细胞克隆,PNP/MePdR自杀基因系统对胰腺癌细胞BXPC-3有较强的抑杀作用.
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