猪δ冠状病毒(PDCoV)和猪流行性腹泻病毒(PEDV)可引起新生仔猪腹泻、呕吐,猪萨佩罗病毒(PSV)可引起猪脑脊髓灰质炎、腹泻等多系统综合征,临床上这3种病毒混合感染很普遍,疾病症状相似,依靠临床症状和剖检变化很难对这3种病毒做鉴别检测,需借助实验室诊断方法.为了建立快速鉴别检测这种病毒的方法,本研究参照GenBank中登录的PEDVM基因、PDCoV N基因和PSV 2C基因的保守序列,利用Prime6.0软件设计3对引物,经各反应条件的优化建立了能同时检测PDCoV、PEDV和PSV的多重RT-PCR方法,并进行特异性、敏感度和重复性试验.结果显示,该方法除了对PDCoV、PEDV和PSV有特异性扩增外,对猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒、猪博卡病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等猪常见病毒的扩增结果均为阴性,特异性较强;建立的多重RT-PCR方法对3种重组质粒标准品的最低检测限分别为1.40×102拷贝/μL(PDCoV)、1.53×102拷贝/μL(PEDV)、1.57×103拷贝/μL(PSV);而以3种质粒标准品为模板的各单一 PCR对PDCoV、PEDV和PSV的检测限分别为1.40×102拷贝/μL、1.53×102拷贝/μL、1.57×102拷贝/μL,该方法虽然对PSV质粒标准品检测的敏感性较低,但总体而言敏感性较高.以PDCoV、PSV病毒核酸及PEDV阳性病料的cDNA为模板,不同时间重复检测3次,检测结果均一致,表明该方法重复性较好.利用该方法和各单一PCR分别对河南部分地市的92份临床腹泻猪的粪便样品和肠道样品进行检测.多重RT-PCR的检测结果显示,PDCoV、PEDV和PSV阳性检出率分别为39.13％(36/92)、57.61％(53/92)和22.83％(21/92);PDCoV、PEDV 和 PSV 3种病毒混合感染样品3份,阳性检出率为3.26％;与单一RT-PCR方法的检测结果均一致,且两种方法的符合率均为100％.本研究建立的多重RT-PCR检测方法为PDCoV、PEDV和PSV的快速检测和流行病学调查提供了技术手段.