目的采用三种浓度冷冻保护剂方案对两周龄未成熟大鼠睾丸组织进行玻璃化冻存,并对冻存效果做出评价。方法根据DMEM/F12培养基中所含二甲基亚砜(DMSO)和乙二醇(EG)的浓度差异,将冻存液分为A、B、C三组,其中DMSO和EG的浓度依次为7.5%、15%、25%。将大鼠睾丸分割为8mm3～9mm3大小的组织块,分别纳入对照组、A组、B组和C组中。对照组的睾丸组织不作冷冻处理,直接进行后续实验;A、B、C三组使用不同浓度的冷冻保护剂进行玻璃化冷冻。冻存2周后,取出样本进行复苏。比较各组睾丸组织的形态学改变,采用免疫荧光染色观察精原细胞标志物UCHL1、支持细胞标志物SOX9、睾丸间质Leydig细胞标志物StAR和细胞增殖核抗原PCNA表达的改变,观察细胞的凋亡情况。结果玻璃化冻存后,未成熟大鼠睾丸组织形态发生一定程度改变,生精细胞及支持细胞标志物表达下降,凋亡增加,与对照组比较均有显著性差异(P<0.05)。三个冻存组中,B组形态学改变最小,细胞标志物表达水平与对照组相差最少,凋亡最少;A组的结构损伤明显,生精上皮与基底膜分离;C组的细胞标志物表达显著下降,凋亡增加最显著。结论冷冻保护剂浓度变化对未成熟睾丸组织玻璃化冻存效果有显著影响,15%DMSO和15%EG组合是玻璃化冻存未成熟大鼠睾丸组织较适宜的冷冻保护剂浓度方案,可为进一步的临床应用提供参考。