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摘 要 目的：探討毛蕊异黄酮（CA）通过调控微RNA-21（miR-21）/人类第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物（PTEN）信号通路对肺腺癌细胞增殖和迁移的抑制作用机制。方法：以人肺腺癌SPC-A1细胞为对象，采用MTT法检测不同剂量CA（5、15、25、50、75、100 μg/mL）作用12、24、48、72 h后的细胞增殖情况，并计算细胞存活率、30%细胞生长抑制浓度（IC30）和半数抑制浓度（IC50）；采用Transwell迁移试验检测低、中、高剂量CA（50、75、100 μg/mL）作用24 h后的细胞迁移情况，记录染色细胞数并计算细胞迁移抑制率；采用蛋白质印迹法和实时聚合酶链反应法检测低、中、高剂量CA（50、75、100 μg/mL）作用24 h后细胞miR-21以及PTEN、血管内皮生长因子（VEGF）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）蛋白及其mRNA的表达情况；检测细胞在分别转染miR-21模拟物（mimic）和抑制物（inhibitor）后，CA（75 μg/mL）对其miR-21及PETN、VEGF、MMP-9蛋白表达的影响。结果：经50、75、100 μg/mL CA作用12、24、48 h，25、50、75、100 μg/mL CA作用72 h后，细胞存活率均显著降低（P<0.05或P<0.01）；12～72 h各时间点CA的IC30值分别为82.24、50.45、46.34、31.81 μg/mL，IC50值分别为108.06、73.35、70.08、49.89 μg/mL。与正常对照组比较，CA各剂量组染色细胞数，低剂量组细胞中VEGF蛋白以及中、高剂量组细胞中miR-21，VEGF、MMP-9蛋白及其mRNA的相对表达量均显著减少或降低，且中、高剂量组显著少于或低于低剂量组，高剂量组显著少于或低于中剂量组（P<0.05或P<0.01）；CA各剂量组细胞迁移率以及中、高剂量组细胞中PTEN蛋白及其mRNA的相对表达量均显著升高，且中、高剂量组显著高于低剂量组，高剂量组显著高于中剂量组（P<0.05或P<0.01）。转染miR-21 mimic后，miR-21 mimic组细胞miR-21及VEGF、MMP-9蛋白的相对表达量均较正常对照组显著升高，PTEN蛋白的相对表达量显著降低（P<0.01）；加入CA干预后，细胞中miR-21及VEGF、MMP-9蛋白的相对表达量均较miR-21 mimic组显著降低，PTEN蛋白的相对表达量均显著升高（P<0.05或P<0.01）。转染miR-21 inhibitor后，miR-21 inhibitor组细胞中miR-21及VEGF、MMP-9蛋白的相对表达量均较正常对照组显著降低，PTEN蛋白的相对表达量显著升高（P<0.05或P<0.01）；加入CA干预后，细胞中miR-21及上述蛋白的表达较miR-21 inhibitor组均未见明显变化（P>0.05）。结论：CA可剂量依赖性地抑制肺腺癌SPC-A1细胞的增殖和迁移，且这种作用可能与调控miR-21/PTEN信号通路有关。
关键词 毛蕊异黄酮；微RNA-21/人类第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物信号通路；肺腺癌；SPC-A1细胞；增殖；迁移；抑制作用；机制
Study on the miR-21/PTEN Signaling Pathway Mechanisms of Calycosin Inhibiting the Proliferation and Migration of Lung Adenocarcinoma Cells
ZHOU Lixia1，GUAN Hongquan1，WANG Chun1，MA Xiande1，WANG Dan2（1. College of Basic Medicine， Liaoning University of TCM， Shenyang 110032， China； 2. Graduate School， Jinzhou Medical University， Liaoning Jinzhou 121001， China）
ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate the mechanism of calycosin （CA） inhibiting the proliferation and migration of lung adenocarcinoma cells by regulating miR-21/PTEN signaling pathway. METHODS： Using lung adenocarcinoma SPC-A1 cells as objects， cell proliferation was detected by MTT method after treated with different doses of CA （5， 15， 25， 50， 75， 100 μg/mL） for 12， 24， 48， 72 h. Cell survival rate， 30% cell growth inhibition concentration （IC30） and half inhibition concentration （IC50） were calculated. Transwell migration test was used to detect the migration of cells after treated with low-dose， medium-dose and high-dose of CA （50， 75， 100 μg/mL） for 24 h. The number of stained cells was recorded and inhibition rate of cell migration were calculated. Western blotting assay and real-time PCR were used to detect the expression of miR-21 as well as the proteins and their mRNAs expression of PTEN， VEGF， MMP-9 after treated with low-dose， medium-dose and high-dose of CA （50， 75， 100 μg/mL） for 24 h. After transfected with miR-21 mimics and miR-21 inhibitor， the effects of CA （75 μg/mL） on the expression of miR-21 and the protein expression of PETN， VEGF and MMP-9 were detected. RESULTS： After treated with 50， 75， 100 μg/mL CA for 12， 24， 48 h， 25， 50， 75， 100 μg/mL CA for 72 h， cell survival rate was decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）. IC30 of CA were 82.24， 50.45， 46.34， 31.81 μg/mL ； IC50 of CA were 108.06， 73.35， 70.08， 49.89 μg/mL during 12-72 h. Compared with normal control group， the number of stained cells in CA groups， protein expression of VEGF in CA low-dose group， expression of miR-21 as well as proteins and their mRNAs expression of VEGF， MMP-9 in CA medium-dose and high-dose groups were decreased significantly； the medium-dose and high-dose groups were significantly less or lower than low-dose group； the high-dose group was significantly less or lower than medium-dose group （P<0.05 or P<0.01）. Cell migration rate of CA groups as well as protein and its mRNA expression of PTEN in CA medium-dose and high-dose groups were increased significantly； the medium-dose and high-dose groups were significantly higher than the low-dose group； the high-dose group was significantly higher than the medium-dose groups （P<0.05 or P<0.01）. After transfected with miR-21 mimics， expression of miR-21 as well as protein expression of VEGF and MMP-9 were increased significantly in miR-21 mimic group， compared with normal control group； protein expression of PTEN was decreased significantly （P<0.01）. After intervened by CA， expression of miR-21 as well as protein expression of VEGF and MMP-9 in cells were decreased significantly， compared with miR-21 mimic group； protein expression of PTEN was increased significantly （P<0.05 or P<0.01）. After transfected with miR-21 inhibitor， expression of miR-21 as well as protein expression of VEGF and MMP-9 were decreased significantly in miR-21 inhibitor group， compared with normal control group； protein expression of PTEN was increased significantly （P<0.05 or P<0.01）. After intervened by CA， the expression of miR-21 and above protein had no significant change in cells， compared with miR-21 inhibitor group （P>0.05）. CONCLUSIONS： CA can inhibit the proliferation and migration of lung adenocarcinoma SPC-A1 cells in a dose-dependent manner， which may be associated with the regulation of miR-21/PTEN signaling pathway. KEYWORDS Calycosin； miR-21/PTEN signaling pathway； Lung adenocarcinoma； SPC-A1 cells； Proliferation； Migration； Inhibitory effect； Mechanism
尽管目前肺癌的诊断和治疗方法取得了显著进展，其近期发病率和病死率均有所下降，但肺癌仍然是呼吸系统最常见的恶性肿瘤之一[1]。肺癌诊断方法的发展虽给患者的生存带来了一定益处，但由于对肺癌发病机制的认知有限，加之其尚缺乏典型的早期症状，故大部分患者确诊时已处于晚期，错失了手术机会，最终导致临床干预效果欠佳[2-3]。肺腺癌作为最为常见的非小细胞肺癌，具有腺体/导管形成、大量黏液产生等病理特征，其发病机制复杂，患者预后较差[4-5]。因此，阐明肺腺癌发生发展的分子调节机制、确定新的早期筛选分子靶点和研发新的治疗药物具有重要意义。
微RNA（microRNAs）是一类广泛存在于真核生物体内、长度约为21～25个核苷酸的内源性非编码蛋白质的进化保守的单链小分子RNA，在确定细胞身份、调控基因表达的过程中发挥着关键作用[6]。同时相关研究证实，microRNAs几乎与所有类型恶性肿瘤的发生、发展密切相关[7]。microRNA-21（miR-21）作为一种参与并促进肿瘤发展的microRNA，被证实可参与调节人类第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物（PTEN）基因的表达[8-9]。PTEN是新近发现的抑癌基因，其编码蛋白PTEN具有脂质磷酸酶活性；此外，该基因缺失可上调下游血管内皮生长因子（VEGF）和基质金属蛋白酶9（MMP-9）编码基因的表达，从而诱导肺癌等多种恶性肿瘤的发展[10-11]。
毛蕊异黄酮（CA）是一种异黄酮类化合物，是中药黄芪的主要活性成分之一，具有低毒、多作用靶点等优点[12]。近年来研究显示，CA具有抗肿瘤活性，可通过抑制丝裂原活化蛋白激酶（MAPR）、蛋白激酶B（Akt）、Janus激酶/信号转导与转录激活因子（JAK/STAT）等信号通路抑制乳腺癌等多种肿瘤细胞的增殖[13-14]，但其对肺腺癌细胞影响的研究较少。为此，本研究拟考察CA对肺腺癌细胞增殖和迁移的体外抑制作用，并从调控miR-21靶向基因PTEN的分子角度初步探讨CA的抗肿瘤机制，以期为明确其干预肺腺癌发展的分子机制、完善肺腺癌的临床治疗方法提供参考。
1 材料
1.1 仪器
ELx 800型酶标仪（美国BioTek公司）、2800-00 Odyssey型双色红外激光成像系统（美国LICOR公司）；PROTEAN Ⅱ xi型垂直电泳系统、170-3940型半干法转膜仪、170-4152型湿法转膜仪、LAS 4000 mini型化学发光成像仪、ABI 7500型荧光定量聚合酶链反应（PCR）仪（美国Bio-Rad公司）；T100型PCR仪、Nano Drop 2000型紫外分光光度计（美国Thermo Fisher Scientific公司）；CKX53型倒置显微镜、BX31型荧光显微镜（日本Olympus公司）；5810R低温高速离心机（德国Eppendorf公司）。
1.2 药品与试剂
CA对照品（批号：B9938，纯度：>98%）、MTT试剂（批号：M2128）均购自美国Sigma公司；磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4，批号：P6504）、蛋白上样缓冲液（批号：P196382-1）、RIPA裂解液（批号：C500005）、免疫印迹化学发光液（ECL）（批号：C510043）均购自生工生物工程（上海）股份有限公司；胰酶（批号：25300054）、青霉素-链霉素双抗（批号：15140163）、胎牛血清（FBS，批号：10100-147）、RPMI 1640培养基（批号：61870044）、Opti-MEM培养基（批号：11058021）均购自美国Gibco公司；TE缓冲液（pH 7.5，上海哈灵生物科技有限公司，批号：HL12441）；Transwell小室（批号：3428）、Matrigel基质胶（批号：356234）均购自美国Corning公司；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific公司，批号：A53225）；Trizol试剂（批号：87902）、实时聚合酶链反应（Real-time PCR）试剂盒（批号：00182806）均购自美国Invitrogen公司；miR-21模拟物（mimic）及其抑制物（inhibitor）的miRNA（批號分别为A0018071、A0028071）均购自苏州吉玛基因股份有限公司；Lipofectamine 2000转染试剂（美国Invitrogen公司，批号：11668019）；逆转录试剂盒（日本Takara公司，批号：D6110A）；小鼠抗人β-肌动蛋白（β-actin）抗体（碧云天生物技术有限公司，批号：AA128）；小鼠抗人PTEN抗体（美国Abcam公司，批号：ab170941）；辣根过氧化物（HRP）标记的羊抗小鼠IgG二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：ab150077）；miR-21、U6引物均由美国GeneCopoeia公司合成；PTEN、MMP-9、VEGF、β-actin引物均由美国Invitrogen公司设计、合成；二甲基亚砜（DMSO）等试剂均为分析纯，水为蒸馏水。
1.3 细胞
人肺腺癌细胞株SPC-A1购自美国ATCC公司。
2 方法
2.1 药液配制
取CA对照品适量，用DMSO溶解，制成质量浓度为100 μg/mL的贮备液，于4 ℃保存，备用。临用前，用PBS将上述贮备液稀释至所需质量浓度，即得。
2.2 细胞培养 Transwell遷移试验结果显示，CA各剂量组染色细胞数均较正常对照组显著减少，且中、高剂量组显著少于低剂量组，高剂量组显著少于中剂量组；细胞迁移抑制率均较正常对照组显著升高，且中、高剂量组显著高于低剂量组，高剂量组显著高于中剂量组。这提示CA能有效抑制SPC-A1细胞的迁移，且呈剂量依耐性。
肿瘤细胞增殖和迁移相关的生物学机制主要包括生长调控机制异常、细胞凋亡异常、细胞运动机制异常和细胞降解机制异常等[23]。PTEN是近年来发现的一种具有双特异性磷酸水解酶功能的抑癌基因，对细胞内多条信号通路具有负性调节作用，与肺癌等多种恶性肿瘤的发展密切相关[24]。VEGF是重要的促血管生长因子，可诱导新生血管形成，从而促进肿瘤细胞的增殖、迁移[25]。MMP（尤其是MMP-9）也被证实在肺癌细胞的迁移和侵袭过程中发挥了重要的作用[26]。有研究指出，肺癌细胞中VEGF、MMP-9蛋白的表达水平是评价肺癌恶性程度的重要指标，也是PTEN参与调控的下游靶点[27]。miRNAs是广泛存在于真核生物体内的内源性干扰RNA，其可通过与靶基因mRNA的3′端结合来发挥抑制靶基因表达的作用，从而参与多种疾病的发生发展过程[28]。其中，miR-21与癌症发生有关，且在多种人类肿瘤细胞中呈过表达[29]；miR-21表达的上调可造成抑癌基因PTEN的表达受到抑制，从而加速肿瘤的病理进展；此外，miR-21也被认为是评价肺癌恶性程度的重要指标之一，可用于患者的肿瘤恶性程度及其预后的评估[30-31]。基于以上理论，本研究初步探讨了CA通过调控miR-21/PTEN信号通路抑制肺腺癌细胞侵袭和转移的分子机制。结果显示，CA中、高剂量组细胞中PTEN蛋白及其mRNA的相对表达量均较正常对照组显著升高，且中、高剂量组显著高于低剂量，高剂量组显著高于中剂量组；CA低剂量组细胞中VEGF蛋白以及中、高剂量组细胞中VEGF、MMP-9蛋白及其mRNA的相对表达量均较正常对照组显著降低，且中、高剂量组显著低于低剂量组，高剂量组显著低于低剂量组。这提示不同剂量的CA均可不同程度地上调PTEN蛋白及其mRNA的表达，下调VEGF、MMP-9蛋白及其mRNA的表达，且呈剂量依赖性。
为进一步验证miR-21对PTEN表达的影响，本研究分别对SPC-A1细胞进行了miR-21 mimic、miR-21 inhibitor转染，并考察了转染后细胞中miR-21及PTEN、VEGF、MMP-9蛋白的表达情况。结果显示，转染miR- 21 mimic后，miR-21 mimic组细胞中miR-21及VEGF、MMP-9蛋白的相对表达量均显著升高，PTEN的相对表达量显著降低；加入CA干预后，细胞中miR-21及VEGF、MMP-9蛋白的相对表达量均较miR-21 mimics组显著降低，PTEN的相对表达量显著升高。转染miR-21 inhibitor后，miR-21 inhibitor组细胞中miR-21及VEGF、MMP- 9蛋白的相对表达量均显著降低，PTEN蛋白的相对表达量显著升高；加入CA干预后，细胞中miR-21及上述蛋白的相对表达量较miR-21 inhibitor组均未发生显著变化。这提示在miR-21过表达的SPC-A1细胞中，CA能明显逆转miR-21诱导的PTEN下调；而在miR-21低表达的SPC-A1细胞中，CA对PTEN表达无明显调控作用，表明CA对肺腺癌SPC-A1细胞增殖、迁移的抑制作用可能是通过抑制miR-21表达、促进PTEN表达来实现的。
综上所述，CA能抑制肺腺癌SPC-A1细胞的增殖和迁移，这种作用可能与调控miR-21/PTEN信号通路有关。本研究可为肺腺癌防治研究提供新的思路，但CA通过PTEN调控VEGF、MMP-9表达的具体机制仍有待于后续研究进一步确证。
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（收稿日期：2018-12-13 修回日期：2019-04-05）
（編辑：张元媛）
关键词 毛蕊异黄酮；微RNA-21/人类第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物信号通路；肺腺癌；SPC-A1细胞；增殖；迁移；抑制作用；机制
Study on the miR-21/PTEN Signaling Pathway Mechanisms of Calycosin Inhibiting the Proliferation and Migration of Lung Adenocarcinoma Cells
ZHOU Lixia1，GUAN Hongquan1，WANG Chun1，MA Xiande1，WANG Dan2（1. College of Basic Medicine， Liaoning University of TCM， Shenyang 110032， China； 2. Graduate School， Jinzhou Medical University， Liaoning Jinzhou 121001， China）
ABSTRACT OBJECTIVE： To investigate the mechanism of calycosin （CA） inhibiting the proliferation and migration of lung adenocarcinoma cells by regulating miR-21/PTEN signaling pathway. METHODS： Using lung adenocarcinoma SPC-A1 cells as objects， cell proliferation was detected by MTT method after treated with different doses of CA （5， 15， 25， 50， 75， 100 μg/mL） for 12， 24， 48， 72 h. Cell survival rate， 30% cell growth inhibition concentration （IC30） and half inhibition concentration （IC50） were calculated. Transwell migration test was used to detect the migration of cells after treated with low-dose， medium-dose and high-dose of CA （50， 75， 100 μg/mL） for 24 h. The number of stained cells was recorded and inhibition rate of cell migration were calculated. Western blotting assay and real-time PCR were used to detect the expression of miR-21 as well as the proteins and their mRNAs expression of PTEN， VEGF， MMP-9 after treated with low-dose， medium-dose and high-dose of CA （50， 75， 100 μg/mL） for 24 h. After transfected with miR-21 mimics and miR-21 inhibitor， the effects of CA （75 μg/mL） on the expression of miR-21 and the protein expression of PETN， VEGF and MMP-9 were detected. RESULTS： After treated with 50， 75， 100 μg/mL CA for 12， 24， 48 h， 25， 50， 75， 100 μg/mL CA for 72 h， cell survival rate was decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）. IC30 of CA were 82.24， 50.45， 46.34， 31.81 μg/mL ； IC50 of CA were 108.06， 73.35， 70.08， 49.89 μg/mL during 12-72 h. Compared with normal control group， the number of stained cells in CA groups， protein expression of VEGF in CA low-dose group， expression of miR-21 as well as proteins and their mRNAs expression of VEGF， MMP-9 in CA medium-dose and high-dose groups were decreased significantly； the medium-dose and high-dose groups were significantly less or lower than low-dose group； the high-dose group was significantly less or lower than medium-dose group （P<0.05 or P<0.01）. Cell migration rate of CA groups as well as protein and its mRNA expression of PTEN in CA medium-dose and high-dose groups were increased significantly； the medium-dose and high-dose groups were significantly higher than the low-dose group； the high-dose group was significantly higher than the medium-dose groups （P<0.05 or P<0.01）. After transfected with miR-21 mimics， expression of miR-21 as well as protein expression of VEGF and MMP-9 were increased significantly in miR-21 mimic group， compared with normal control group； protein expression of PTEN was decreased significantly （P<0.01）. After intervened by CA， expression of miR-21 as well as protein expression of VEGF and MMP-9 in cells were decreased significantly， compared with miR-21 mimic group； protein expression of PTEN was increased significantly （P<0.05 or P<0.01）. After transfected with miR-21 inhibitor， expression of miR-21 as well as protein expression of VEGF and MMP-9 were decreased significantly in miR-21 inhibitor group， compared with normal control group； protein expression of PTEN was increased significantly （P<0.05 or P<0.01）. After intervened by CA， the expression of miR-21 and above protein had no significant change in cells， compared with miR-21 inhibitor group （P>0.05）. CONCLUSIONS： CA can inhibit the proliferation and migration of lung adenocarcinoma SPC-A1 cells in a dose-dependent manner， which may be associated with the regulation of miR-21/PTEN signaling pathway. KEYWORDS Calycosin； miR-21/PTEN signaling pathway； Lung adenocarcinoma； SPC-A1 cells； Proliferation； Migration； Inhibitory effect； Mechanism
尽管目前肺癌的诊断和治疗方法取得了显著进展，其近期发病率和病死率均有所下降，但肺癌仍然是呼吸系统最常见的恶性肿瘤之一[1]。肺癌诊断方法的发展虽给患者的生存带来了一定益处，但由于对肺癌发病机制的认知有限，加之其尚缺乏典型的早期症状，故大部分患者确诊时已处于晚期，错失了手术机会，最终导致临床干预效果欠佳[2-3]。肺腺癌作为最为常见的非小细胞肺癌，具有腺体/导管形成、大量黏液产生等病理特征，其发病机制复杂，患者预后较差[4-5]。因此，阐明肺腺癌发生发展的分子调节机制、确定新的早期筛选分子靶点和研发新的治疗药物具有重要意义。
微RNA（microRNAs）是一类广泛存在于真核生物体内、长度约为21～25个核苷酸的内源性非编码蛋白质的进化保守的单链小分子RNA，在确定细胞身份、调控基因表达的过程中发挥着关键作用[6]。同时相关研究证实，microRNAs几乎与所有类型恶性肿瘤的发生、发展密切相关[7]。microRNA-21（miR-21）作为一种参与并促进肿瘤发展的microRNA，被证实可参与调节人类第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物（PTEN）基因的表达[8-9]。PTEN是新近发现的抑癌基因，其编码蛋白PTEN具有脂质磷酸酶活性；此外，该基因缺失可上调下游血管内皮生长因子（VEGF）和基质金属蛋白酶9（MMP-9）编码基因的表达，从而诱导肺癌等多种恶性肿瘤的发展[10-11]。
毛蕊异黄酮（CA）是一种异黄酮类化合物，是中药黄芪的主要活性成分之一，具有低毒、多作用靶点等优点[12]。近年来研究显示，CA具有抗肿瘤活性，可通过抑制丝裂原活化蛋白激酶（MAPR）、蛋白激酶B（Akt）、Janus激酶/信号转导与转录激活因子（JAK/STAT）等信号通路抑制乳腺癌等多种肿瘤细胞的增殖[13-14]，但其对肺腺癌细胞影响的研究较少。为此，本研究拟考察CA对肺腺癌细胞增殖和迁移的体外抑制作用，并从调控miR-21靶向基因PTEN的分子角度初步探讨CA的抗肿瘤机制，以期为明确其干预肺腺癌发展的分子机制、完善肺腺癌的临床治疗方法提供参考。
1 材料
1.1 仪器
ELx 800型酶标仪（美国BioTek公司）、2800-00 Odyssey型双色红外激光成像系统（美国LICOR公司）；PROTEAN Ⅱ xi型垂直电泳系统、170-3940型半干法转膜仪、170-4152型湿法转膜仪、LAS 4000 mini型化学发光成像仪、ABI 7500型荧光定量聚合酶链反应（PCR）仪（美国Bio-Rad公司）；T100型PCR仪、Nano Drop 2000型紫外分光光度计（美国Thermo Fisher Scientific公司）；CKX53型倒置显微镜、BX31型荧光显微镜（日本Olympus公司）；5810R低温高速离心机（德国Eppendorf公司）。
1.2 药品与试剂
CA对照品（批号：B9938，纯度：>98%）、MTT试剂（批号：M2128）均购自美国Sigma公司；磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4，批号：P6504）、蛋白上样缓冲液（批号：P196382-1）、RIPA裂解液（批号：C500005）、免疫印迹化学发光液（ECL）（批号：C510043）均购自生工生物工程（上海）股份有限公司；胰酶（批号：25300054）、青霉素-链霉素双抗（批号：15140163）、胎牛血清（FBS，批号：10100-147）、RPMI 1640培养基（批号：61870044）、Opti-MEM培养基（批号：11058021）均购自美国Gibco公司；TE缓冲液（pH 7.5，上海哈灵生物科技有限公司，批号：HL12441）；Transwell小室（批号：3428）、Matrigel基质胶（批号：356234）均购自美国Corning公司；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific公司，批号：A53225）；Trizol试剂（批号：87902）、实时聚合酶链反应（Real-time PCR）试剂盒（批号：00182806）均购自美国Invitrogen公司；miR-21模拟物（mimic）及其抑制物（inhibitor）的miRNA（批號分别为A0018071、A0028071）均购自苏州吉玛基因股份有限公司；Lipofectamine 2000转染试剂（美国Invitrogen公司，批号：11668019）；逆转录试剂盒（日本Takara公司，批号：D6110A）；小鼠抗人β-肌动蛋白（β-actin）抗体（碧云天生物技术有限公司，批号：AA128）；小鼠抗人PTEN抗体（美国Abcam公司，批号：ab170941）；辣根过氧化物（HRP）标记的羊抗小鼠IgG二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：ab150077）；miR-21、U6引物均由美国GeneCopoeia公司合成；PTEN、MMP-9、VEGF、β-actin引物均由美国Invitrogen公司设计、合成；二甲基亚砜（DMSO）等试剂均为分析纯，水为蒸馏水。
1.3 细胞
人肺腺癌细胞株SPC-A1购自美国ATCC公司。
2 方法
2.1 药液配制
取CA对照品适量，用DMSO溶解，制成质量浓度为100 μg/mL的贮备液，于4 ℃保存，备用。临用前，用PBS将上述贮备液稀释至所需质量浓度，即得。
2.2 细胞培养 Transwell遷移试验结果显示，CA各剂量组染色细胞数均较正常对照组显著减少，且中、高剂量组显著少于低剂量组，高剂量组显著少于中剂量组；细胞迁移抑制率均较正常对照组显著升高，且中、高剂量组显著高于低剂量组，高剂量组显著高于中剂量组。这提示CA能有效抑制SPC-A1细胞的迁移，且呈剂量依耐性。
肿瘤细胞增殖和迁移相关的生物学机制主要包括生长调控机制异常、细胞凋亡异常、细胞运动机制异常和细胞降解机制异常等[23]。PTEN是近年来发现的一种具有双特异性磷酸水解酶功能的抑癌基因，对细胞内多条信号通路具有负性调节作用，与肺癌等多种恶性肿瘤的发展密切相关[24]。VEGF是重要的促血管生长因子，可诱导新生血管形成，从而促进肿瘤细胞的增殖、迁移[25]。MMP（尤其是MMP-9）也被证实在肺癌细胞的迁移和侵袭过程中发挥了重要的作用[26]。有研究指出，肺癌细胞中VEGF、MMP-9蛋白的表达水平是评价肺癌恶性程度的重要指标，也是PTEN参与调控的下游靶点[27]。miRNAs是广泛存在于真核生物体内的内源性干扰RNA，其可通过与靶基因mRNA的3′端结合来发挥抑制靶基因表达的作用，从而参与多种疾病的发生发展过程[28]。其中，miR-21与癌症发生有关，且在多种人类肿瘤细胞中呈过表达[29]；miR-21表达的上调可造成抑癌基因PTEN的表达受到抑制，从而加速肿瘤的病理进展；此外，miR-21也被认为是评价肺癌恶性程度的重要指标之一，可用于患者的肿瘤恶性程度及其预后的评估[30-31]。基于以上理论，本研究初步探讨了CA通过调控miR-21/PTEN信号通路抑制肺腺癌细胞侵袭和转移的分子机制。结果显示，CA中、高剂量组细胞中PTEN蛋白及其mRNA的相对表达量均较正常对照组显著升高，且中、高剂量组显著高于低剂量，高剂量组显著高于中剂量组；CA低剂量组细胞中VEGF蛋白以及中、高剂量组细胞中VEGF、MMP-9蛋白及其mRNA的相对表达量均较正常对照组显著降低，且中、高剂量组显著低于低剂量组，高剂量组显著低于低剂量组。这提示不同剂量的CA均可不同程度地上调PTEN蛋白及其mRNA的表达，下调VEGF、MMP-9蛋白及其mRNA的表达，且呈剂量依赖性。
为进一步验证miR-21对PTEN表达的影响，本研究分别对SPC-A1细胞进行了miR-21 mimic、miR-21 inhibitor转染，并考察了转染后细胞中miR-21及PTEN、VEGF、MMP-9蛋白的表达情况。结果显示，转染miR- 21 mimic后，miR-21 mimic组细胞中miR-21及VEGF、MMP-9蛋白的相对表达量均显著升高，PTEN的相对表达量显著降低；加入CA干预后，细胞中miR-21及VEGF、MMP-9蛋白的相对表达量均较miR-21 mimics组显著降低，PTEN的相对表达量显著升高。转染miR-21 inhibitor后，miR-21 inhibitor组细胞中miR-21及VEGF、MMP- 9蛋白的相对表达量均显著降低，PTEN蛋白的相对表达量显著升高；加入CA干预后，细胞中miR-21及上述蛋白的相对表达量较miR-21 inhibitor组均未发生显著变化。这提示在miR-21过表达的SPC-A1细胞中，CA能明显逆转miR-21诱导的PTEN下调；而在miR-21低表达的SPC-A1细胞中，CA对PTEN表达无明显调控作用，表明CA对肺腺癌SPC-A1细胞增殖、迁移的抑制作用可能是通过抑制miR-21表达、促进PTEN表达来实现的。
综上所述，CA能抑制肺腺癌SPC-A1细胞的增殖和迁移，这种作用可能与调控miR-21/PTEN信号通路有关。本研究可为肺腺癌防治研究提供新的思路，但CA通过PTEN调控VEGF、MMP-9表达的具体机制仍有待于后续研究进一步确证。
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（收稿日期：2018-12-13 修回日期：2019-04-05）
（編辑：张元媛）