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【摘要】 目的：探讨ETV1在胃肠道间质瘤组织中的表达及临床意义。方法：应用免疫组化、实时荧光定量PCR、Western-blot检测ETV1在135例不同胃肠道间质瘤患者的肿瘤组织及瘤旁组织中的表达。结果：免疫组化结果显示，ETV1在胃肠道间质瘤中阳性表达率为68.1%，显著高于瘤旁正常组织的5.2%（P<0.05）。荧光定量PCR方法显示，间质瘤组织中ETV1的相对表达Ct值（3.30±2.37）低于瘤旁正常组织的（6.19±2.86），肿瘤组织中ETV1的表达是正常组织的7.41倍，差异有统计学意义（P<0.001）。Western-blot法检测显示，ETV1蛋白在胃肠道间质瘤中的表达水平（1.24±0.67）也较瘤旁正常组织高（0.88±0.28）（P=0.0369）；Pearson相关分析显示，ETV1mRNA和蛋白水平呈正相关（r=0.526，P=0.017）。结论：ETV1在胃肠道间质瘤中特异性高表达，可能与胃肠道间质瘤的发生发展有关，有望成为新的肿瘤标志物，为临床治疗提供新靶点。
【关键词】 胃肠道间质瘤； 转录调控因子； 肿瘤发生
【Abstract】 Objective：To investigate the expression of ETV1 in gastrointestinal stromal tumors and its clinical significance.Method：Surgical gastrointestinal stromal tumor tissues and adjacent normal mucosa were obtained from 135 patients with gastrointestinal stromal tumor.Immunohistochemistry was conducted to detect the distribution of ETV1 protein，while the quantitative real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction and Western blot method were used to detect the expressions of ETV1 mRNA and protein.Result：Immunohistochemical analysis showed the positive rate of ETV1 expression was 68.1% in gastrointestinal stromal tumor tissues，it was significantly higher than 5.2% in the adjacent normal samples（P<0.05）.Fluorescence quantitative polymerase chain reaction （PCR） showed that relative expression of Ct value was （3.30±2.37）in gastrointestinal stromal tumor tissues，it was significantly lower than （6.19±2.86） in adjacent normal samples，expression of ETV1 in tumor tissue was 7.41 times of normal tissue，the difference was statistically significant（P<0.001）.Western blot analysis revealed that the expression of ETV1 protein was （1.24±0.67） in gastrointestinal stromal tumor tissues，it was significantly higher than （0.88±0.28） in normal colorectal tissues （P=0.0369）.Pearson correlation analysis showed that the mRNA level was in positive correlation with the protein level（r=0.526，P=0.017）.Conclusion：The specific expression of the ETV1 is in a correlation with the pathogenesis of gastrointestinal stromal tumor.ETV1 is expected to be a new tumor marker and the new target for clinical therapy.
【Key words】 Gastrointestinal stromal tumor； Transcription regulatory factors； Tumorigenesis
First-author’s address：The First Affiliated Hospital of Zhejiang University Medical College，Hangzhou 310000，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.25.001
ETS家族是最大的信号依赖转录调控因子家族之一，其过度表达和许多人类肿瘤发生有关，近年来已成为各国学者关注的重点。ETS变异体1（ETV1，ER81）是ETS家族成员之一。已有研究表明，ETV1在乳腺癌、黑色素瘤、前列腺癌、尤文氏瘤中过度表达，参与肿瘤的形成和发展[1-5]。国外已有研究发现，ETV1在胃肠道间质瘤（gastrointestinal stromal tumor，GIST）细胞中存在普遍高表达[6]，但是国内鲜有相关报道。本实验采用免疫组织化学、实时荧光定量PCR和Western-blot方法检测GIST及瘤旁正常组织中ETV1的表达，探索其表达差异的意义。 1 材料与方法
1.1 标本来源 选取本院2012年5月-2014年1月经手术治疗的GIST患者135例。其中男68例，女67例，年龄24～83岁，平均（58.7±11.8）岁，中位年龄59岁。肿瘤发生部位包括胃104例，小肠24例，其他部位7例。所有手术病例均为初治，术前均未行放、化疗或伊马替尼等分子靶向治疗。GIST标本取自病灶中央无坏死部分，另取距肿瘤边缘大于3 cm的瘤旁正常组织，离体后立即切成大约0.5 cm小块，于10 min内放于液氮中保存，后转存于-80 ℃冰箱。部分标本用4%甲醛固定，石蜡包埋，做免疫组化染色。所有标本均经过病理科医师证实为GIST。本实验获得医院伦理委员会同意。
1.2 免疫组化染色 组织石蜡包埋制成厚约4 μm组织切片，常规HE染色和免疫组化染色。每批染色均用已知阳性切片做阳性对照，用PBS代替一抗做阴性对照。结果判定：以胞质、胞核或胞膜染有均匀棕黄色颗粒、染色强度高于背景非特异性染色者为阳性细胞。采用双盲法，选取5个高倍视野进行计数。按半定量评分方法进行计算：根据每视野着色细胞占总细胞的数目（阳性细胞0、1%～25%、26%～50%、>50%）分别记为0、1、2、3分；按每张切片着色细胞的染色强度（阴性、弱、中、强）分别记为0、1、2、3分；根据两项评分之和判断结果：≤2分为阴性，≥3为阳性。
1.3 RT-PCR检测ETV1 mRNA表达
1.3.1 总RNA提取 称取100 mg组织，匀浆后用TRIzol法进行GIST组织及瘤旁组织的总RNA提取。紫外分光光度计定量并检测其纯度，A260/A280比值在1.8～2.0。按照Takara PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser （Perfect Real Time）试剂盒（Takara公司）说明书步骤将其逆转录为cDNA。
1.3.2 实时荧光定量PCR ETV1正向引物为
5’-GCAGTCAAGAACAGCCCTTTA-3’，反向引物为
5’-TCAGGTTTCGGTGTATGAGTTG-3’。以GAPDH为内参照，其正向引物为5’-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3’，反向引物为5’-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3’。取cDNA 1 μL，按照SYBR? Premix Ex Taq? （Tli RNaseH Plus）试剂盒（Takara公司）说明书步骤进行反应，95 ℃预变性30 s，随后进行40个循环的PCR扩增反应（95 ℃变性5 s，60 ℃退火与延伸34 s）。肿瘤组织与正常组织的相对表达Ct值，即?Ct=Ct（ETV1）-Ct（GAPDH）。肿瘤组织中ETV1表达相对于瘤旁正常组织的倍数用2-??Ct计算。
1.4 Western blot法检测ETV1蛋白表达 取100 mg新鲜组织，将组织粉碎后加入裂解液提取总蛋白，4 ℃离心10 min，提取上清液，BCA法测定蛋白含量。在提取出的蛋白中加入适量5×上样缓冲液煮沸10 min。取等量样本于10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，电转移至硝酸纤维素膜（NC膜）。5%脱脂牛奶室温封闭2 h，与兔抗人ETV1单克隆抗体或GAPDH单克隆抗体4 ℃孵育过夜，洗膜，与辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔多克隆抗体室温孵育1 h，洗膜。用ECL显色曝光。组织中不同蛋白表达水平用目的条带与内参GAPDH条带的灰度值比值定量表示。
1.5 统计学处理 采用SPSS 19.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验和单因素方差分析，计数资料用率表示，采用 字2检验，Kruskal—Wallis等级相关采用Spearman方法，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 ETV1的免疫组化染色结果 ETV1免疫组化阳性染色产物位于细胞核。ETV1在GIST中普遍高表达，阳性率达68.1%（92/135），但是在瘤旁正常组织基本不表达，为5.2%（7/135），差异具有统计学意义（P<0.05），见图1。
3 讨论
GIST是消化系统最常见的间叶源性肿瘤，它主要是由c-kit或者PDGFRA基因致瘤突变导致，发病率约为1/10万～2/10万人，近年来呈明显增加的趋势。伊马替尼等分子靶向药物的应用，极大地提高了GIST的药物疗效。但是，伊马替尼的成功应用并未根除间质瘤，肿瘤复发和耐药成为影响疗效的关键因素[7-8]。因此，探索GIST表面分子特性，寻找新的分子靶标已成为目前GIST诊治研究的热点。
ETS家族是最大的信号依赖转录调控因子家族之一，现已发现30多个ETS家族成员，它们均含有一个由85个氨基酸组成的特异DNA结合区（ETS区），该区与靶基因启动区一个富含嘌呤的序列GGAA/T结合后调节基因转录。ETV1是ETS家族成员之一，ETV1及其相关ETS转录因子可以调控多能祖细胞分化，在组织发育过程中差异表达，过度表达促进细胞恶性改变[9-10]。在一些肿瘤中ETV1基因参与某些染色体易位突变，基因融合产生嵌合体蛋白导致细胞恶性变，被认为是促使肿瘤发生的主要因素之一，如前列癌中ETV1和跨膜丝氨酸蛋白酶2基因的融合、尤文氏肉瘤中ETV-1和EWS基因的融合[1，5]。前列腺癌中过度表达的ETV1也可以和雄激素受体作用促成肿瘤的侵袭与转移[11]。其他肿瘤如黑色素瘤、乳腺癌中也存在ETV1蛋白过度表达，在调控肿瘤细胞增殖中起重要作用[2-4]。进一步研究表明，ETV1对靶基因的作用由复杂的调控网络进行调节。各种信号激活Ras/Raf/MAPK信号通路是调控ETV1的主要途径[2，12-13]。Ras/Raf/MAPK通路的激活导致ETS转录因子活化，从而调控生长和周期相关基因，如c-myc、junB、cdc2和cyclinD139[14]。在ETS的参与作用下，Ras信号成功转化成一系列生长、凋亡相关基因。在前列腺癌、黑色素瘤中，Ras-MAPK-ETV1通路进一步得到了验证，Ras-MAPK的激活是调控ETV1的主要途径[2，12-13]。Chi等[6]研究发现，ETV1在伊马替尼敏感或耐药GIST细胞中普遍表达，且ETV1在GIST中的表达水平明显高于其他肿瘤，如胃癌、肝癌、结直肠癌、前列腺癌、黑色素瘤、卵巢癌等。ETV1能够与KIT协同作用，调控GIST细胞的增殖凋亡与恶性转变。 本研究结果表明，ETV1在GIST组织中的基因和蛋白表达水平均显著上调，在瘤旁正常组织很少表达，与Chi等[6]研究结果符合。该结果提示ETV1在GIST中特异性表达，可能与肿瘤的发生发展具有相关性。但是否将ETV1的表达作为评估肿瘤恶性程度及预测发展仍有待进一步研究。深入探索ETV1在GIST发生发展中的可能作用机制，将为GIST的诊治提供新的思路。
参考文献
[1] Ordó?ez J L，Osuna D，Herrero D，et al.Advances in Ewing's sarcoma research：where are we now and what lies ahead？[J].Cancer Res，2009，69（18）：7140-7150.
[2] Jané-Valbuena J，Widlund H R，Perner S，et al.An oncogenic role for ETV1 in melanoma[J].Cancer Res，2010，70（5）：2075-2084.
[3] Baker R，Kent C V，Silbermann R A，et al.Pea3 transcription factors and wnt1-induced mouse mammary neoplasia[J].Plos One，2010，5（1）：e8854.
[4] Vageli D，Ioannou M G，Koukoulis G K.Transcriptional activation of hTERT in breast carcinomas by the Her2-ER81-related pathway[J].Oncol Res，2009，17（9）：413-423.
[5] Oh S，Shin S，Janknecht R.ETV1，4 and 5：an oncogenic subfamily of ETS transcription factors[J].Biochimicaet Biophysica Acta，2012，1826（1）：1-12.
[6] Chi P，Chen Y，Zhang L，et al.ETV1 is a lineage survival factor that cooperates with KIT in gastrointestinal stromal tumours[J].Nature，2010，467（7317）：849-853.
[7] Duffaud F，Blay J Y.Gastrointestinal stromal tumors：biology and treatment[J].Oncology，2003，65（3）：187-197.
[8] Braconi C，Bracci R，Cellerino R.Molecular targets in Gastrointestinal Stromal Tumors （GIST） therapy[J].Curr Cancer Drug Targets，2008，8（5）：359-366.
[9] Kurpios N A，MacNeil L，Shepherd T G，et al.The Pea3 Ets transcription factor regulates differentiation of multipotent progenitor cells during mammary gland development[J].Dev Biol，2009，325（1）：106-121.
[10] De Launoit Y，Baert J L，Chotteau-Lelievre A，et al.The Ets transcription factors of the PEA3 group：transcriptional regulators in metastasis[J].Biochim Biophys Acta，2006，1766（1）：79-87.
[11] Shin S，Kim T D，Jin F，et al.Induction of prostatic intraepithelial neoplasia and modulation of androgen receptor by ETS variant 1/ETS-related protein 81[J].Cancer Res，2009，69（20）：8102-8110.
[12] Dwyer J，Li H，Xu D，et al.Transcriptional regulation of telomerase activity：roles of the the Ets transcription factor family[J].Ann N Y Acad Sci，2007，1114（10）：36-47.
[13] Goueli B S，Janknecht R.Upregulation of the catalytic telomerase subunit by the transcription factor ER81 and oncogenic HER2/Neu，Ras，or Raf[J].Mol Cell Biol，2004，24（1）：25-35.
[14] Oikawa T.ETS transcription factors：possible targets for cancer therapy[J].Cancer Sci，2004，95（8）：626-633.
（收稿日期：2014-03-27） （本文编辑：欧丽）
【关键词】 胃肠道间质瘤； 转录调控因子； 肿瘤发生
【Abstract】 Objective：To investigate the expression of ETV1 in gastrointestinal stromal tumors and its clinical significance.Method：Surgical gastrointestinal stromal tumor tissues and adjacent normal mucosa were obtained from 135 patients with gastrointestinal stromal tumor.Immunohistochemistry was conducted to detect the distribution of ETV1 protein，while the quantitative real-time reverse transcriptase polymerase chain reaction and Western blot method were used to detect the expressions of ETV1 mRNA and protein.Result：Immunohistochemical analysis showed the positive rate of ETV1 expression was 68.1% in gastrointestinal stromal tumor tissues，it was significantly higher than 5.2% in the adjacent normal samples（P<0.05）.Fluorescence quantitative polymerase chain reaction （PCR） showed that relative expression of Ct value was （3.30±2.37）in gastrointestinal stromal tumor tissues，it was significantly lower than （6.19±2.86） in adjacent normal samples，expression of ETV1 in tumor tissue was 7.41 times of normal tissue，the difference was statistically significant（P<0.001）.Western blot analysis revealed that the expression of ETV1 protein was （1.24±0.67） in gastrointestinal stromal tumor tissues，it was significantly higher than （0.88±0.28） in normal colorectal tissues （P=0.0369）.Pearson correlation analysis showed that the mRNA level was in positive correlation with the protein level（r=0.526，P=0.017）.Conclusion：The specific expression of the ETV1 is in a correlation with the pathogenesis of gastrointestinal stromal tumor.ETV1 is expected to be a new tumor marker and the new target for clinical therapy.
【Key words】 Gastrointestinal stromal tumor； Transcription regulatory factors； Tumorigenesis
First-author’s address：The First Affiliated Hospital of Zhejiang University Medical College，Hangzhou 310000，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.25.001
ETS家族是最大的信号依赖转录调控因子家族之一，其过度表达和许多人类肿瘤发生有关，近年来已成为各国学者关注的重点。ETS变异体1（ETV1，ER81）是ETS家族成员之一。已有研究表明，ETV1在乳腺癌、黑色素瘤、前列腺癌、尤文氏瘤中过度表达，参与肿瘤的形成和发展[1-5]。国外已有研究发现，ETV1在胃肠道间质瘤（gastrointestinal stromal tumor，GIST）细胞中存在普遍高表达[6]，但是国内鲜有相关报道。本实验采用免疫组织化学、实时荧光定量PCR和Western-blot方法检测GIST及瘤旁正常组织中ETV1的表达，探索其表达差异的意义。 1 材料与方法
1.1 标本来源 选取本院2012年5月-2014年1月经手术治疗的GIST患者135例。其中男68例，女67例，年龄24～83岁，平均（58.7±11.8）岁，中位年龄59岁。肿瘤发生部位包括胃104例，小肠24例，其他部位7例。所有手术病例均为初治，术前均未行放、化疗或伊马替尼等分子靶向治疗。GIST标本取自病灶中央无坏死部分，另取距肿瘤边缘大于3 cm的瘤旁正常组织，离体后立即切成大约0.5 cm小块，于10 min内放于液氮中保存，后转存于-80 ℃冰箱。部分标本用4%甲醛固定，石蜡包埋，做免疫组化染色。所有标本均经过病理科医师证实为GIST。本实验获得医院伦理委员会同意。
1.2 免疫组化染色 组织石蜡包埋制成厚约4 μm组织切片，常规HE染色和免疫组化染色。每批染色均用已知阳性切片做阳性对照，用PBS代替一抗做阴性对照。结果判定：以胞质、胞核或胞膜染有均匀棕黄色颗粒、染色强度高于背景非特异性染色者为阳性细胞。采用双盲法，选取5个高倍视野进行计数。按半定量评分方法进行计算：根据每视野着色细胞占总细胞的数目（阳性细胞0、1%～25%、26%～50%、>50%）分别记为0、1、2、3分；按每张切片着色细胞的染色强度（阴性、弱、中、强）分别记为0、1、2、3分；根据两项评分之和判断结果：≤2分为阴性，≥3为阳性。
1.3 RT-PCR检测ETV1 mRNA表达
1.3.1 总RNA提取 称取100 mg组织，匀浆后用TRIzol法进行GIST组织及瘤旁组织的总RNA提取。紫外分光光度计定量并检测其纯度，A260/A280比值在1.8～2.0。按照Takara PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser （Perfect Real Time）试剂盒（Takara公司）说明书步骤将其逆转录为cDNA。
1.3.2 实时荧光定量PCR ETV1正向引物为
5’-GCAGTCAAGAACAGCCCTTTA-3’，反向引物为
5’-TCAGGTTTCGGTGTATGAGTTG-3’。以GAPDH为内参照，其正向引物为5’-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3’，反向引物为5’-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3’。取cDNA 1 μL，按照SYBR? Premix Ex Taq? （Tli RNaseH Plus）试剂盒（Takara公司）说明书步骤进行反应，95 ℃预变性30 s，随后进行40个循环的PCR扩增反应（95 ℃变性5 s，60 ℃退火与延伸34 s）。肿瘤组织与正常组织的相对表达Ct值，即?Ct=Ct（ETV1）-Ct（GAPDH）。肿瘤组织中ETV1表达相对于瘤旁正常组织的倍数用2-??Ct计算。
1.4 Western blot法检测ETV1蛋白表达 取100 mg新鲜组织，将组织粉碎后加入裂解液提取总蛋白，4 ℃离心10 min，提取上清液，BCA法测定蛋白含量。在提取出的蛋白中加入适量5×上样缓冲液煮沸10 min。取等量样本于10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，电转移至硝酸纤维素膜（NC膜）。5%脱脂牛奶室温封闭2 h，与兔抗人ETV1单克隆抗体或GAPDH单克隆抗体4 ℃孵育过夜，洗膜，与辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔多克隆抗体室温孵育1 h，洗膜。用ECL显色曝光。组织中不同蛋白表达水平用目的条带与内参GAPDH条带的灰度值比值定量表示。
1.5 统计学处理 采用SPSS 19.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验和单因素方差分析，计数资料用率表示，采用 字2检验，Kruskal—Wallis等级相关采用Spearman方法，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 ETV1的免疫组化染色结果 ETV1免疫组化阳性染色产物位于细胞核。ETV1在GIST中普遍高表达，阳性率达68.1%（92/135），但是在瘤旁正常组织基本不表达，为5.2%（7/135），差异具有统计学意义（P<0.05），见图1。
3 讨论
GIST是消化系统最常见的间叶源性肿瘤，它主要是由c-kit或者PDGFRA基因致瘤突变导致，发病率约为1/10万～2/10万人，近年来呈明显增加的趋势。伊马替尼等分子靶向药物的应用，极大地提高了GIST的药物疗效。但是，伊马替尼的成功应用并未根除间质瘤，肿瘤复发和耐药成为影响疗效的关键因素[7-8]。因此，探索GIST表面分子特性，寻找新的分子靶标已成为目前GIST诊治研究的热点。
ETS家族是最大的信号依赖转录调控因子家族之一，现已发现30多个ETS家族成员，它们均含有一个由85个氨基酸组成的特异DNA结合区（ETS区），该区与靶基因启动区一个富含嘌呤的序列GGAA/T结合后调节基因转录。ETV1是ETS家族成员之一，ETV1及其相关ETS转录因子可以调控多能祖细胞分化，在组织发育过程中差异表达，过度表达促进细胞恶性改变[9-10]。在一些肿瘤中ETV1基因参与某些染色体易位突变，基因融合产生嵌合体蛋白导致细胞恶性变，被认为是促使肿瘤发生的主要因素之一，如前列癌中ETV1和跨膜丝氨酸蛋白酶2基因的融合、尤文氏肉瘤中ETV-1和EWS基因的融合[1，5]。前列腺癌中过度表达的ETV1也可以和雄激素受体作用促成肿瘤的侵袭与转移[11]。其他肿瘤如黑色素瘤、乳腺癌中也存在ETV1蛋白过度表达，在调控肿瘤细胞增殖中起重要作用[2-4]。进一步研究表明，ETV1对靶基因的作用由复杂的调控网络进行调节。各种信号激活Ras/Raf/MAPK信号通路是调控ETV1的主要途径[2，12-13]。Ras/Raf/MAPK通路的激活导致ETS转录因子活化，从而调控生长和周期相关基因，如c-myc、junB、cdc2和cyclinD139[14]。在ETS的参与作用下，Ras信号成功转化成一系列生长、凋亡相关基因。在前列腺癌、黑色素瘤中，Ras-MAPK-ETV1通路进一步得到了验证，Ras-MAPK的激活是调控ETV1的主要途径[2，12-13]。Chi等[6]研究发现，ETV1在伊马替尼敏感或耐药GIST细胞中普遍表达，且ETV1在GIST中的表达水平明显高于其他肿瘤，如胃癌、肝癌、结直肠癌、前列腺癌、黑色素瘤、卵巢癌等。ETV1能够与KIT协同作用，调控GIST细胞的增殖凋亡与恶性转变。 本研究结果表明，ETV1在GIST组织中的基因和蛋白表达水平均显著上调，在瘤旁正常组织很少表达，与Chi等[6]研究结果符合。该结果提示ETV1在GIST中特异性表达，可能与肿瘤的发生发展具有相关性。但是否将ETV1的表达作为评估肿瘤恶性程度及预测发展仍有待进一步研究。深入探索ETV1在GIST发生发展中的可能作用机制，将为GIST的诊治提供新的思路。
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[13] Goueli B S，Janknecht R.Upregulation of the catalytic telomerase subunit by the transcription factor ER81 and oncogenic HER2/Neu，Ras，or Raf[J].Mol Cell Biol，2004，24（1）：25-35.
[14] Oikawa T.ETS transcription factors：possible targets for cancer therapy[J].Cancer Sci，2004，95（8）：626-633.
（收稿日期：2014-03-27） （本文编辑：欧丽）