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摘要：在单因素实验的基础上，进行3因素3水平的Box-Behnken中心组合实验设计，利用响应面分析优化■荷多糖的最佳提取工艺；对此工艺下的提取液进行浓缩，通过牛津杯法和二倍稀释法探讨其抑菌活性。结果表明：在优化工艺条件处理温度91.67℃、液料比25.0mL/g、处理时间1.5h时，■荷多糖得率为10.15%，与预测值9.94%的相对误差仅2.07%；■荷多糖对大肠杆菌、黑曲霉和酿酒酵母没有体外抑制作用，但对枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌有体外抑制作用，其MIC分别为0.4930mg/mL、1.9722mg/mL，MBC分别为1.9722mg/mL、7.8886mg/mL。■荷多糖可作为一种新型抗菌药物开发，其提取工艺可用响应面法进行回归分析和参数优化。
关键词：多糖；■荷；响应面；提取工艺；体外抑菌
项目基金：安徽省高校自然科学研究重点项目（KJ2018A0413）；安徽省林业科技攻关团队（2017062）；安徽省林业科技攻关计划项目（2018061）；安徽省2018年度重点研究与开发计划项目（编号：1804g07020182）
中图分类号： R931.71 文献标识码： A DOI编号： 10.14025/j.cnki.jlny.2018.14.029
■荷（Zingiber mioga （Thunb.） Rosc. ），又名陽荷、茗荷、观音花、莲花姜、野姜等，属药食两用的姜科多年生草本植物，广泛分布我国南方地区。而植物多糖具有抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、增强免疫、调节造血功能等多种功效。但目前有关■荷多糖的研究仍比较少见，仅谭志伟等研究了传统的热浸提工艺和提取物的抗氧化性[1，2]，陈仕学等研究了微波辅助提取工艺[3]，邱岚等研究了超声辅助提取工艺[4]，朱培蕾等研究了■荷水溶性多糖的理化性质及其体外抗氧化活性[5]。本文在响应面法优化■荷多糖提取工艺的基础上，对其抗菌活性进行研究，以期为■荷资源的有效开发和新型抗菌药物的获得提供前期基础。
1 材料与方法
1.1 仪器与材料
HH恒温水浴锅（金坛市金城国胜实验仪器厂），SHZ-D循环水真空泵（郑州予华仪器有限公司），H2050R台式高速大容量冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司），ZD-85气浴恒温振荡器（金坛市杰瑞尔有限公司），DHP-9272数显电热培养箱（上海浦东荣丰科学仪器有限公司），YX-450电热蒸汽压力消毒器（上海三申医疗器械有限公司），SW-CJ-1C洁净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）等。硫酸、苯酚等均为分析纯（西陇化工股份有限公司）。■荷从大别山区采集。实验菌株包括以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）为代表的革兰阳性细菌，以大肠杆菌（Escherichia coli）为代表的革兰阴性细菌，以黑曲霉（Aspergillus niger）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）为代表的真菌。
1.2 实验方法
1.2.1 ■荷多糖的测定 根据苯酚-硫酸法，设置葡萄糖标准液的浓度梯度，建立其吸光度与葡萄糖质量M（μg）的线性关系，从而计算■荷多糖质量[6]。
1.2.2 确定单因素范围
（1） 处理温度（X1）：分别称取3.0g过80目筛的■荷粉末，计5组3个重复共15份；每份用45mL蒸馏水溶于三角瓶后，各组分别置于20℃、40℃、60℃、80℃、100℃的水浴中浸提2h；提取液4000转速离心10min，Sevag法脱蛋白后滤液50mL容量瓶定容；取100uL提取液稀释100倍，稀释提取液，取其1mL按苯酚-硫酸法测定多糖浓度，以确定处理温度。
（2）液料比（X2）：同上，按10mL/g的液料比梯度，确定15～45mL/g范围内的液料比。
（3）处理时间（X3）：同上，按0.5h的时间梯度，确定1～3h范围内的处理时间。
1.2.3 响应面优化 响应面采用Design-Expert.8.0.6软件设计，处理温度（X1）、液料比（X2）和处理时间（X3）为自变量，■荷多糖提取得率（Y）为响应值。
1.2.4 体外抑菌 纯化供试菌种制成菌悬液备用。■荷多糖浓缩物体外抑菌效果以牛津杯法测定；■荷多糖最低抑菌浓度（MIC）以二倍稀释法测定，对有抑菌效果的二倍稀释液移种到培养基上，根据培养皿中菌落生长情况测定■荷多糖最小杀菌浓度（MBC）[7]。
2 结果与分析
2.1 ■荷多糖的测定
经测定，吸光度A与多糖质量M的线性关系为A=0.007M+0.0038，R=0.9998，相关系数符合国家标准高于0.99的要求，可作为测定依据[8]。
2.2 确定单因素范围
表1 不同处理温度对提取效果的影响
注：dfA=4，dfe=10；SSA=10.5976，SSe=0.9003；Sx=0.1732；**表示组间差异极显著。
2.2.1 处理温度 由表1的SSR法检验可见，在80℃～100℃时，■荷多糖的得率最高，与其他各组差异极显著（P<0.01）；但在80℃～100℃之间差异不显著（P>0.01），响应面法可进一步优化筛选此温度范围。考虑能源消耗，确定其他单因素范围时可暂定80℃。
2.2.2 液料比 由表2的SSR法检验可见，随着液料比的进一步提高，■荷多糖的得率极显著降低（P<0.01）；但在15～25mL/g时差异不显著（P>0.01），响应面法可进一步于5～25mL/g区间筛选液料比范围，确定其他单因素范围时可暂定液料比为15mL/g。
表2 不同液料比对提取效果的影响 注：dfA=3，dfe=8；SSA=2.2840，SSe=0.8691；Sx=0.1903；**表示组间差异极显著。
2.2.3 处理时间筛选试验 由表3的SSR法检验可见，随着处理时间的增加或减少，■荷多糖得率都会极显著性降低（P<0.01），■荷多糖得率最高时的处理时间为2h，响应面法筛选范围可选择1.5～2.5h区间。
表3 不同处理时间对提取效果的影响
注：dfA=4，dfe=10；SSA=16.2721，SSe=0.6024；Sx=0.1417；**表示组间差异极显著，*表示显著。
2.3 响应面优化
2.3.1 回归方程与统计检验
响应面试验结果见表4，经二次回归分析得模型方程：Y=-44.16144+1.41778X1-0.050725X2-13.3595X3+0.00115X1X2
-0.0485X1X3-0.011X2X3-0.0074925X12+0.0046325X22+4.423X32。
表4 ■荷多糖提取响应面设计试验方案及结果
根据数字模型方差分析结果看（表5）：模型的F=33.28、（Prob>F）<0.0001，表明该模型显著而具有统计学意义；模型失拟项（Prob>F）=0.0564>0.05，表明失拟项不显著，实验和模型拟合程度好；模型的相关系数R2=0.9772>0.95，说明模型拟合度好而具有高可信度；变异系数（CV）=4.73%，信噪比22.552>4，表明模型方程能客观反映实验值。可见■荷多糖提取工艺可以凭该模型来预测。在模型方程中，X2偏回归系数显著（P<0.05），说明液料比对■荷多糖提取的效应影响显著。
表5 ■荷多糖提取工艺优化数学模型方差分析
2.3.2 ■荷多糖提取的响应面分析
综合图1、图2、图3可见：随着料液比的增加■荷多糖提取得率提高；随着处理温度的上升■荷多糖提取得率先提高后降低；随着处理时间的延长■荷多糖提取得率先降低后提高。三者之间未见交互效应。
2.3.3 试验验证
经软件优化计算，在处理温度91.67℃、液料比25.0mL/g、处理时间1.5h时，■荷多糖的提取得率最大，达到9.94%。此工艺条件下验证结果证实，■荷多糖实际提取得率10.15%，与预测值相对误差仅2.07%。
2.4 体外抑菌试验
2.4.1 牛津杯法测定■荷多糖抑菌效果
由图4、图5可知，■荷多糖浓缩液（7.8886mg/mL）对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌有明显的体外抑制作用；但对大肠杆菌、黑曲霉和酿酒酵母未见体外抑制作用。其中，■荷多糖对金黄色葡萄球菌的平均抑菌圈直径为15.5mm；对枯草芽孢杆菌的平均抑菌圈直径为9.6mm。
2.4.2 ■荷多糖的MIC、MBC测定（图6，图7）
由图6可见，■荷多糖的浓缩液在第4支试管，即1/16倍稀释前，试管中的金黄色葡萄球菌生长受抑制、培养液清亮，之后金黄色葡萄球菌生长、培养液混浊。各试管稀释液转种于培养皿后，至第2支试管，即1/4倍稀释液在培养皿上的菌落数小于5个，而第3支试管开始，即1/8倍稀释液转种于培养皿后，菌落数多于5个。说明■荷多糖对金黄色葡萄球菌的MIC为其浓缩液的1/16倍稀释液，即0.4930mg/mL；MBC为其浓缩液的1/4倍稀释液，即1.9722mg/mL。
由图7可见，■荷多糖的浓缩液在第2支试管，即1/4倍稀释前，试管中的枯草芽孢杆菌生长受抑制、培养液清亮，之后金黄色葡萄球菌生长、培养液混浊。各试管稀释液转种于培养皿后，第1支试管，即1/2倍稀释液在培养皿上的菌落數就多于5个，仅浓缩液原液的培养液在培养皿上未见菌落生长。说明■荷多糖对枯草芽孢杆菌的MIC为其浓缩液的1/4倍稀释液，即1.9722mg/mL；MBC为其浓缩液原液，即7.8886mg/mL。
3 结论
本研究以■荷为原料，运用响应面法建立■荷多糖提取工艺的数学回归模型为：Y=-44.16144+1.41778X1-0.050725X2-
13.3595X3+0.00115X1X2-0.0485X1X3-0.011X2X3-0.0074925X12+
0.0046325X22+4.423X32。通过模型得知■荷多糖的最佳工艺为处理温度91.67℃、液料比25.0mL/g、处理时间1.5h，此工艺时■荷多糖实际提取得率达到10.15%，与预测值9.94%的相对误差仅2.07%，表明响应面法适用于对■荷多糖提取得率进行参数优化与回归分析。此工艺条件下提取的■荷多糖进行体外抑菌试验，结果牛津杯法表明■荷多糖浓缩液在7.8886mg/mL时，对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌有体外抑制作用，对大肠杆菌、黑曲霉和酿酒酵母没有体外抑制作用；■荷多糖对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的MIC分别为0.4930mg/mL、1.9722mg/mL，MBC分别为1.9722mg/mL、7.8886mg/mL。
参考文献
[1]谭志伟，余爱农.茗荷水溶性多糖提取及抗氧化性能测定[J].湖北农业科学，2008，47（02）：211-213.
[2]谭志伟.茗荷水溶性多糖体外抗氧化性能的研究[J].安徽农业科学，2008，36（02）：433-434，628.
[3]陈仕学，沈家国，陈波，等. 微波辅助提取梵净山阳荷多糖的工艺优化[J].食品与发酵工业，2013，39（05）：234-237.
[4]邱岚，陈仕学，王红梅.超声波辅助提取阳荷多糖的工艺研究[J].食品工业，2013，34（08）：21-24.
[5]朱培蕾，汪名春，赵士伟，等. ■荷水溶性多糖的理化性质及其体外抗氧化活性[J].食品工业科技，2017，38（02）：136-140.
[6]张惟杰.糖复合物生化研究技术[M].杭州：浙江大学出版社，1999：132-136.
[7]黄仁术，易凡.金荞麦（-）表儿茶素类活性物质体外抑菌试验[J].江苏农业科学，2015，43（01）：3087-310.
[8]GB/T 27404-2008，实验室质量控制规范-食品理化检测[S].2008.
作者简介：黄仁术，硕士，副教授，研究方向：天然活性物质研究。
关键词：多糖；■荷；响应面；提取工艺；体外抑菌
项目基金：安徽省高校自然科学研究重点项目（KJ2018A0413）；安徽省林业科技攻关团队（2017062）；安徽省林业科技攻关计划项目（2018061）；安徽省2018年度重点研究与开发计划项目（编号：1804g07020182）
中图分类号： R931.71 文献标识码： A DOI编号： 10.14025/j.cnki.jlny.2018.14.029
■荷（Zingiber mioga （Thunb.） Rosc. ），又名陽荷、茗荷、观音花、莲花姜、野姜等，属药食两用的姜科多年生草本植物，广泛分布我国南方地区。而植物多糖具有抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、增强免疫、调节造血功能等多种功效。但目前有关■荷多糖的研究仍比较少见，仅谭志伟等研究了传统的热浸提工艺和提取物的抗氧化性[1，2]，陈仕学等研究了微波辅助提取工艺[3]，邱岚等研究了超声辅助提取工艺[4]，朱培蕾等研究了■荷水溶性多糖的理化性质及其体外抗氧化活性[5]。本文在响应面法优化■荷多糖提取工艺的基础上，对其抗菌活性进行研究，以期为■荷资源的有效开发和新型抗菌药物的获得提供前期基础。
1 材料与方法
1.1 仪器与材料
HH恒温水浴锅（金坛市金城国胜实验仪器厂），SHZ-D循环水真空泵（郑州予华仪器有限公司），H2050R台式高速大容量冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司），ZD-85气浴恒温振荡器（金坛市杰瑞尔有限公司），DHP-9272数显电热培养箱（上海浦东荣丰科学仪器有限公司），YX-450电热蒸汽压力消毒器（上海三申医疗器械有限公司），SW-CJ-1C洁净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）等。硫酸、苯酚等均为分析纯（西陇化工股份有限公司）。■荷从大别山区采集。实验菌株包括以枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）为代表的革兰阳性细菌，以大肠杆菌（Escherichia coli）为代表的革兰阴性细菌，以黑曲霉（Aspergillus niger）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）为代表的真菌。
1.2 实验方法
1.2.1 ■荷多糖的测定 根据苯酚-硫酸法，设置葡萄糖标准液的浓度梯度，建立其吸光度与葡萄糖质量M（μg）的线性关系，从而计算■荷多糖质量[6]。
1.2.2 确定单因素范围
（1） 处理温度（X1）：分别称取3.0g过80目筛的■荷粉末，计5组3个重复共15份；每份用45mL蒸馏水溶于三角瓶后，各组分别置于20℃、40℃、60℃、80℃、100℃的水浴中浸提2h；提取液4000转速离心10min，Sevag法脱蛋白后滤液50mL容量瓶定容；取100uL提取液稀释100倍，稀释提取液，取其1mL按苯酚-硫酸法测定多糖浓度，以确定处理温度。
（2）液料比（X2）：同上，按10mL/g的液料比梯度，确定15～45mL/g范围内的液料比。
（3）处理时间（X3）：同上，按0.5h的时间梯度，确定1～3h范围内的处理时间。
1.2.3 响应面优化 响应面采用Design-Expert.8.0.6软件设计，处理温度（X1）、液料比（X2）和处理时间（X3）为自变量，■荷多糖提取得率（Y）为响应值。
1.2.4 体外抑菌 纯化供试菌种制成菌悬液备用。■荷多糖浓缩物体外抑菌效果以牛津杯法测定；■荷多糖最低抑菌浓度（MIC）以二倍稀释法测定，对有抑菌效果的二倍稀释液移种到培养基上，根据培养皿中菌落生长情况测定■荷多糖最小杀菌浓度（MBC）[7]。
2 结果与分析
2.1 ■荷多糖的测定
经测定，吸光度A与多糖质量M的线性关系为A=0.007M+0.0038，R=0.9998，相关系数符合国家标准高于0.99的要求，可作为测定依据[8]。
2.2 确定单因素范围
表1 不同处理温度对提取效果的影响
注：dfA=4，dfe=10；SSA=10.5976，SSe=0.9003；Sx=0.1732；**表示组间差异极显著。
2.2.1 处理温度 由表1的SSR法检验可见，在80℃～100℃时，■荷多糖的得率最高，与其他各组差异极显著（P<0.01）；但在80℃～100℃之间差异不显著（P>0.01），响应面法可进一步优化筛选此温度范围。考虑能源消耗，确定其他单因素范围时可暂定80℃。
2.2.2 液料比 由表2的SSR法检验可见，随着液料比的进一步提高，■荷多糖的得率极显著降低（P<0.01）；但在15～25mL/g时差异不显著（P>0.01），响应面法可进一步于5～25mL/g区间筛选液料比范围，确定其他单因素范围时可暂定液料比为15mL/g。
表2 不同液料比对提取效果的影响 注：dfA=3，dfe=8；SSA=2.2840，SSe=0.8691；Sx=0.1903；**表示组间差异极显著。
2.2.3 处理时间筛选试验 由表3的SSR法检验可见，随着处理时间的增加或减少，■荷多糖得率都会极显著性降低（P<0.01），■荷多糖得率最高时的处理时间为2h，响应面法筛选范围可选择1.5～2.5h区间。
表3 不同处理时间对提取效果的影响
注：dfA=4，dfe=10；SSA=16.2721，SSe=0.6024；Sx=0.1417；**表示组间差异极显著，*表示显著。
2.3 响应面优化
2.3.1 回归方程与统计检验
响应面试验结果见表4，经二次回归分析得模型方程：Y=-44.16144+1.41778X1-0.050725X2-13.3595X3+0.00115X1X2
-0.0485X1X3-0.011X2X3-0.0074925X12+0.0046325X22+4.423X32。
表4 ■荷多糖提取响应面设计试验方案及结果
根据数字模型方差分析结果看（表5）：模型的F=33.28、（Prob>F）<0.0001，表明该模型显著而具有统计学意义；模型失拟项（Prob>F）=0.0564>0.05，表明失拟项不显著，实验和模型拟合程度好；模型的相关系数R2=0.9772>0.95，说明模型拟合度好而具有高可信度；变异系数（CV）=4.73%，信噪比22.552>4，表明模型方程能客观反映实验值。可见■荷多糖提取工艺可以凭该模型来预测。在模型方程中，X2偏回归系数显著（P<0.05），说明液料比对■荷多糖提取的效应影响显著。
表5 ■荷多糖提取工艺优化数学模型方差分析
2.3.2 ■荷多糖提取的响应面分析
综合图1、图2、图3可见：随着料液比的增加■荷多糖提取得率提高；随着处理温度的上升■荷多糖提取得率先提高后降低；随着处理时间的延长■荷多糖提取得率先降低后提高。三者之间未见交互效应。
2.3.3 试验验证
经软件优化计算，在处理温度91.67℃、液料比25.0mL/g、处理时间1.5h时，■荷多糖的提取得率最大，达到9.94%。此工艺条件下验证结果证实，■荷多糖实际提取得率10.15%，与预测值相对误差仅2.07%。
2.4 体外抑菌试验
2.4.1 牛津杯法测定■荷多糖抑菌效果
由图4、图5可知，■荷多糖浓缩液（7.8886mg/mL）对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌有明显的体外抑制作用；但对大肠杆菌、黑曲霉和酿酒酵母未见体外抑制作用。其中，■荷多糖对金黄色葡萄球菌的平均抑菌圈直径为15.5mm；对枯草芽孢杆菌的平均抑菌圈直径为9.6mm。
2.4.2 ■荷多糖的MIC、MBC测定（图6，图7）
由图6可见，■荷多糖的浓缩液在第4支试管，即1/16倍稀释前，试管中的金黄色葡萄球菌生长受抑制、培养液清亮，之后金黄色葡萄球菌生长、培养液混浊。各试管稀释液转种于培养皿后，至第2支试管，即1/4倍稀释液在培养皿上的菌落数小于5个，而第3支试管开始，即1/8倍稀释液转种于培养皿后，菌落数多于5个。说明■荷多糖对金黄色葡萄球菌的MIC为其浓缩液的1/16倍稀释液，即0.4930mg/mL；MBC为其浓缩液的1/4倍稀释液，即1.9722mg/mL。
由图7可见，■荷多糖的浓缩液在第2支试管，即1/4倍稀释前，试管中的枯草芽孢杆菌生长受抑制、培养液清亮，之后金黄色葡萄球菌生长、培养液混浊。各试管稀释液转种于培养皿后，第1支试管，即1/2倍稀释液在培养皿上的菌落數就多于5个，仅浓缩液原液的培养液在培养皿上未见菌落生长。说明■荷多糖对枯草芽孢杆菌的MIC为其浓缩液的1/4倍稀释液，即1.9722mg/mL；MBC为其浓缩液原液，即7.8886mg/mL。
3 结论
本研究以■荷为原料，运用响应面法建立■荷多糖提取工艺的数学回归模型为：Y=-44.16144+1.41778X1-0.050725X2-
13.3595X3+0.00115X1X2-0.0485X1X3-0.011X2X3-0.0074925X12+
0.0046325X22+4.423X32。通过模型得知■荷多糖的最佳工艺为处理温度91.67℃、液料比25.0mL/g、处理时间1.5h，此工艺时■荷多糖实际提取得率达到10.15%，与预测值9.94%的相对误差仅2.07%，表明响应面法适用于对■荷多糖提取得率进行参数优化与回归分析。此工艺条件下提取的■荷多糖进行体外抑菌试验，结果牛津杯法表明■荷多糖浓缩液在7.8886mg/mL时，对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌有体外抑制作用，对大肠杆菌、黑曲霉和酿酒酵母没有体外抑制作用；■荷多糖对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的MIC分别为0.4930mg/mL、1.9722mg/mL，MBC分别为1.9722mg/mL、7.8886mg/mL。
参考文献
[1]谭志伟，余爱农.茗荷水溶性多糖提取及抗氧化性能测定[J].湖北农业科学，2008，47（02）：211-213.
[2]谭志伟.茗荷水溶性多糖体外抗氧化性能的研究[J].安徽农业科学，2008，36（02）：433-434，628.
[3]陈仕学，沈家国，陈波，等. 微波辅助提取梵净山阳荷多糖的工艺优化[J].食品与发酵工业，2013，39（05）：234-237.
[4]邱岚，陈仕学，王红梅.超声波辅助提取阳荷多糖的工艺研究[J].食品工业，2013，34（08）：21-24.
[5]朱培蕾，汪名春，赵士伟，等. ■荷水溶性多糖的理化性质及其体外抗氧化活性[J].食品工业科技，2017，38（02）：136-140.
[6]张惟杰.糖复合物生化研究技术[M].杭州：浙江大学出版社，1999：132-136.
[7]黄仁术，易凡.金荞麦（-）表儿茶素类活性物质体外抑菌试验[J].江苏农业科学，2015，43（01）：3087-310.
[8]GB/T 27404-2008，实验室质量控制规范-食品理化检测[S].2008.
作者简介：黄仁术，硕士，副教授，研究方向：天然活性物质研究。