【摘 要】
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带有GFP基因的ES D3细胞系是一个良好的可以用于研究体内和体外细胞分化和组织产生的模型.用磷酸钙共沉淀法将质粒pEGFP-N2导入小鼠胚胎干细胞D3细胞系中,在荧光显微镜下以48
【机 构】
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浙江大学生命科学学院,天水师范学院生命科学与化学学院,中国科学院遗传与发育生物学研究所,浙江省湖州市中心医院
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带有GFP基因的ES D3细胞系是一个良好的可以用于研究体内和体外细胞分化和组织产生的模型.用磷酸钙共沉淀法将质粒pEGFP-N2导入小鼠胚胎干细胞D3细胞系中,在荧光显微镜下以488nm激发光检查阳性克隆,并进行初步扩增.经G418筛选后,机械挑取EGFP强阳性表达的克隆,并在丝裂霉素C处理的小鼠胚胎成纤维细胞的饲养层上,在无选择性压力的条件下,进一步扩大培养,获得纯化的转染细胞系.20代以后,转染细胞仍然表达绿色荧光蛋白.PCR检测表明8代和18代转染细胞均携带有GFP标志基因.对稳定表达EGFP的干细胞系进行碱性磷酸酶染色、拟胚体和畸胎瘤形成的检测,证明这些细胞具有干细胞的特征.经拟胚体,可进一步分化成具有搏动能力的心肌细胞,分化百分率为30%～40%,较未转染细胞60%～70%的分化率低,造成低分化率机制还不清楚.这些细胞在激光共聚焦显微镜下呈绿色荧光,免疫组化染色显示具心肌细胞特异的cTnT分子标志.该EGFP标记的干细胞系带有可进行原位、实时检测的绿色荧光,可应用于细胞移植和体内分化的研究.
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