【目的】探索药用昆虫中华蜂(Apis cerana cerana Fabricius)体内可培养放线菌的分离方法,研究其物种多样性及抗菌活性,挖掘更多微生物资源。【方法】选用7种分离培养基对中华蜂样品体内放线菌进行分离;通过采用16S rRNA PCR-RFLP和16S rRNA基因序列分析方法研究其多样性;选用4种致病菌对菌株进行抗菌活性初探。【结果】共分离得到180株放线菌,根据菌落的形态和细胞特征观察结果,从中选取84株作为代表菌株,其分属于3个目、4个科中的4个属,其中6株为潜在新种;最适的表面消毒方法:浓度为0.2%的Cl O2(二氧化氯)作为消毒剂,作用60 s;拮抗实验显示,31.0%、48.8%、27.4%、16.7%的代表菌株分别对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、玉米弯孢病菌、西瓜枯萎病菌有不同程度的抗菌活性,71.4%的代表菌株对至少一种病原菌有拮抗作用。【结论】分离方法的选择对昆虫体内放线菌的分离效果影响较大;中华蜂体内放线菌具有丰富的多样性,展现出很好的抗菌活性,表明其在发现新型生物活性物质中具有很大的潜力。