【摘 要】
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用PCR技术从腐蹄病E型节瘤拟杆菌克隆出具免疫保护性抗原0.93 kb纤毛蛋白基因 (Pili基因),利用该基因构建了纤毛蛋白基因表达载体.先将PCR产物Pili基因克隆于TA C loning Sys
【机 构】
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中国农业科学院,澳大利亚悉尼大学,解放军军需大学
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用PCR技术从腐蹄病E型节瘤拟杆菌克隆出具免疫保护性抗原0.93 kb纤毛蛋白基因 (Pili基因),利用该基因构建了纤毛蛋白基因表达载体.先将PCR产物Pili基因克隆于TA C loning System,扩增后,用EcoRⅠ酶切,低熔点胶回收,经Klenow补平后,用T4DNA连接酶与中间载体pPLλ连接,将Pili基因克隆于pPLλ载体;经BamHⅠ、BglⅡ、PvuⅡ和SmalⅠ+BglⅡ酶切鉴定和pPLλ-Pili重组质粒Pili基因序列测定正确后,扩增pPLλ-Pili重组质粒,用BamHⅠ酶切出2.1kb大小的片段,回收后,与pME290表达质粒连接,转染宿主细胞PAK/2pfs,在营养肉汤中进行Pili基因的表达.培养18～24 h后,离心,向上清液中加入0.1mol/L MgCl2提取重组纤毛蛋白.用羊抗兔E型节瘤拟杆菌抗血清与提取的重组纤毛蛋白进行对流免疫电泳,证明重组纤毛蛋白具有特异性;染料结合法测定1000mL上清液中表达纤毛蛋白粗含量约为114mg.SDS-PAGE 测定重组纤毛蛋白的表达量占总菌量的11.8%,Western blot确证其为重组纤毛蛋白.
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