【摘 要】
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目的 建立SYBR Green Ⅰ染料实时定量PCR检测生存素(Survivin)基因定量的方法.方法 根据PCR产物荧光强度、循环阈值(Ct值)、标准曲线斜率、相关系数和熔解曲线优化反应体系中
【机 构】
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华中科技大学同济医学院附属协和医院检验科,华中科技大学同济医学院附属襄樊医院检验科
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目的 建立SYBR Green Ⅰ染料实时定量PCR检测生存素(Survivin)基因定量的方法.方法 根据PCR产物荧光强度、循环阈值(Ct值)、标准曲线斜率、相关系数和熔解曲线优化反应体系中各组分的量及反应条件,对引物二聚体消除策略和Ct值获取方式进行评价.并用该方法检测43份胃癌组织Survivin基因扩增情况.结果 SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR体系扩增Survivin的最佳组成和条件是:Taq酶2.5 U/100μ1、MgCl2 2 mmol/L、引物浓度0.2 μmol/L和退火温度58℃;在PCR循环延伸结束后设置1个低于特异产物退火温度值2℃的荧光读取温度,能有效消除引物二聚体对定量检测的影响;以二次倒数最大值方式确定Ct值,能避免主观因素所致误差.研究建立的SYBR Green Ⅰ染料实时定量PCR检测Survivin基因含量方法的灵敏度为10拷贝/μl,线性范围101～104拷贝/μl(r=0.999 7),批内变异系数(CV)1.13%～1.91%,批间CV 3.31%～4.50%;胃癌组织中Survivin基因扩增率为13.9%(6/43).结论 优化后的SYBR Green Ⅰ实时定量PCR方法具有方便、经济、灵敏度高和重复好等特性,可用于Survivin基因含量分析.
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