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[摘要] 目的 观察自发性高血压大鼠（SHR）心肌内小冠脉重构（IMSAs）与巨噬细胞、肥大细胞及细胞间粘附分子-1（ICAM-1）的关系，以及替米沙坦对血管重构及炎症影响的干预作用。 方法12周龄的自发性高血压大鼠，随机分为无干预的SHR组（SHR）、高剂量替米沙坦组（Tel_H）和低剂量替米沙坦（Tel_L）组，对照组为周龄、性别、体重配对的WKY大鼠（WKY），每组均为10只；Tel_H组和Tel_L组每日分别予替米沙坦8mg/kg、0.8mg/kg灌胃；SHR组和WKY组予2mL蒸馏水灌胃。实验进行18周。实验开始和结束时进行血压测定。取大鼠左心室切片经苦味酸-天狼猩红（Sirus-red）染色。利用计算机辅助成像系统计算IMSAs的血管壁面积（WA）、血管腔面积（LA）和血管壁面积百分比（%WA）。免疫组化染色以识别巨噬细胞及细胞间粘附分子-1等。甲苯胺蓝染色显示心肌肥大细胞。 结果30周龄时SHR组血压（200.50±14.15）mm Hg比WKY组（116.30±9.38）mm Hg明显升高，差异有统计学意义（P<0.01）；Tel_H组血压（119.40±14.69）mm Hg明显低于SHR组（P<0.01），而与WKY组差异无统计学意义（P>0.05）；Tel_L组血压（193.30±15.19）mm Hg与SHR组相比差异无统计学意义（P>0.05）。SHR组IMSAs与WKY组IMSAs相比，WA及%WA显著增高，LA明显减小（P均<0.01）；Tel_H组IMSAs与SHR组IMSAs相比，WA与%WA显著减小（P<0.01），而LA增大（P<0.05）；Tel_H组与WKY组WA无显著差异，LA减小（P<0.05），而%WA增大（P<0.01）。SHR组心肌组织中巨噬细胞和肥大细胞数量明显多于WKY组（P均<0.01）；Tel_H组和Tel_L组巨噬细胞和肥大细胞数量均显著少于SHR组（P<0.01）。SHR组心肌的ICAM-1光密度（IOD）显著高于WKY组（P<0.01），Tel_H组和Tel_L组心肌ICAM-1的IOD均显著低于SHR组（P<0.01）。 结论30周龄SHR心肌内小冠脉重构与心肌组织中的巨噬细胞、肥大细胞数量及ICAM-1的表达相关，替米沙坦治疗能明显减轻SHR心肌内小冠脉重构，减少心肌组织中的巨噬细胞、肥大细胞数量及ICAM-1的表达。
[关键词] 自发性高血压大鼠；心肌内小冠脉重构；巨噬细胞；肥大细胞；细胞间粘附分子-1；替米沙坦
[中图分类号] R544.1 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2013）21-19-06
当前的研究认为高血压可能是一种慢性炎症性疾病[1]。在动物实验中发现，自发性高血压大鼠（SHR）体内存在着炎症细胞的激活，炎症细胞激活参与了左室肥厚等心血管重构过程[2-4]。Kubo等[5]观察到20周龄的SHR发生了冠状动脉重构，同时发现巨噬细胞在冠状动脉的浸润增多。在给予外源性血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导的高血压大鼠模型也了发现单核巨噬细胞在血管周围的浸润增多[6]。我们前期的研究发现30周龄自发性高血压大鼠血压显著升高，同时心肌内小冠脉（IMSAs）发生明显重构[7]。但IMSAs重构与炎症之间关系尚不明确。本研究探讨了SHR心肌内小冠脉重构与巨噬细胞、肥大细胞及细胞间粘附分子-1（ICAM-1）的关系，以及替米沙坦对SHR心肌内小冠脉重构及炎症影响的干预作用。
1 材料与方法
1.1 动物分组及干预
12周龄雄性自发性高血压大鼠（SHR）30只，体重250～300g，随机分为3组，每组均为10只，分别为无干预的高血压组（SHR组）、高剂量替米沙坦组（Tel_H组）和低剂量替米沙坦组（Tel_L组）。年龄、性别、体重与SHR相配对的WKY大鼠10只为正常血压、无干预对照组（WKY组）。Tel_L和Tel_H组分别按大鼠体重给予替米沙坦0.8mg/（kg·d）、8mg/（kg·d）溶解于2mL蒸馏水中，于每日上午8时灌胃；SHR组和WKY组予2mL蒸馏水每日上午8时灌胃。所有动物均购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，合格证书号：SCXK（沪2003-0003）。所有大鼠自由摄食、饮用冷开水，每12小时光照与黑暗循环交替。
1.2 试剂及仪器
羊抗大鼠细胞间粘附分子-1（ICAM-1）抗体冻干粉（克隆号：EWL1408，规格：1μg/mL）购自R&D Systems，Inc。鼠抗人巨噬细胞单克隆抗体浓缩液（CD68，1︰500，克隆号：ED1）、SP-9000免疫组化试剂盒和AEC显色剂购自北京中杉生物技术有限公司。替米沙坦（商品名：美卡素，国药准字J20040100），由德国勃林格殷格翰公司提供。RBP-1B型大鼠血压心率测定仪（北京中日友好医院临床研究所），BBX41显微镜（Olympus，Japan），计算机辅助图像分析系统（Image-Pro Plus 5.1）。
1.3 大鼠血压测定
在实验开始及结束时用RBP-1B型大鼠血压仪分别测量各组大鼠尾动脉收缩压（SBP）。每次测量3次，取平均值。
1.4 标本处理
大鼠饲养18周，至30周龄时结束实验。静脉内注射10%氯化钾2～3mL处死大鼠，迅速开胸取出心脏，10%PBS甲醛溶液固定20～30min后置于10%PBS甲醛中保存。所有心脏标本垂直左心室长轴从心尖部起连续切取3块组织块，常规石蜡包埋后，每个组织块做连续切片。
1.5 分析方法
行苦味酸-天狼猩红（Sirus-red）染色后，应用显微镜计算机辅助图像分析系统，选取内径10～150μm血管每切片计数8～10个，取平均值。依据Tanaka[8]介绍的方法对IMSAs壁横截面积（WA）、管腔面积（LA）及平均血管壁面积百分比（%WA）进行测定并计算。巨噬细胞应用ED1免疫组化染色，肥大细胞应用甲苯胺蓝染色，每张切片随机取10个视野，计算每平方毫米阳性细胞数（个/mm2）。ICAM-1应用免疫组化染色，每张切片随机取10个视野，在计算机图像分析系统下测定抗体积分光密度值（IOD）。 1.6 统计学处理
用SPSS13.0统计软件进行分析，所有实验数据以（）表示，组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）、LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组大鼠血压的变化
12周龄的SHR血压明显高于同龄WKY大鼠；30周龄时SHR组血压比WKY组明显升高，差异有统计学意义（P<0.01）；Tel_H组血压明显低于SHR组（P<0.01），而与WKY组无显著差异（P>0.05）；Tel_L组血压与SHR组相比无显著差异（P>0.05）。见表1。
2.2 各组大鼠IMSAs的重构
各组大鼠IMSAs的形态学变化（Sirus-red染色）见图1。（1）SHR组IMSAs与WKY组IMSAs相比，管壁面积及管腔面积百分比明显增高，管腔面积显著减小（P均<0.01）。（2）Tel_H组IMSAs与SHR组IMSAs相比，管壁面积与管腔面积百分比明显减小（P<0.01），而管腔面积增大（P>0.05）。Tel_H组IMSAs与WKY组IMSAs相比，管壁面积差异无统计学意义（P>0.05），管腔面积减小（P<0.01），而管腔面积百分比明显增大（P<0.01）。（3）Tel_L组IMSAs与SHR组IMSAs相比，管壁面积无明显差异（P>0.05），管腔面积与管腔面积百分比明显减小（P<0.01）；Tel_L组IMSAs与WKY组IMSAs相比，管壁面积与管腔面积百分比明显增高、管腔面积显著减小（P均<0.01）。（4）Tel_H组IMSAs与Tel_L组IMSAs相比，管壁面积与管腔面积百分比明显减小（P<0.01），管腔面积差异无统计学意义（P>0.05）。以上结果说明，30周龄SHR的IMSAs发生明显重构，管腔面积明显减小而管壁面积显著增大，因而管壁面积百分比增加更为显著。18周的替米沙坦治疗可抑制或逆转自发性高血压大鼠的心肌内小冠脉的重构，且高剂量的替米沙坦对小冠脉重构的减轻程度要强于低剂量的替米沙坦。见表2。
2.3 各组大鼠心肌中的巨噬细胞计数
大鼠心肌中的巨噬细胞主要分布在血管周围纤维化灶中和心外膜，多呈局灶性聚集。本实验计数血管周围巨噬细胞而排除心外膜下巨噬细胞。各组大鼠心肌中巨噬细胞（个/mm2）计数如下：SHR组：19.7±6.0；WKY组：5.3±3.2；Tel_H组：9.7±4.2；Tel_L组：14.5±5.7。SHR组巨噬细胞明显多于WKY组（P<0.01），Tel_H组和Tel_L组与SHR组相比巨噬细胞明显减少（P分别<0.05，0.01）。见图2。
2.4 各组大鼠心肌中的肥大细胞计数
各组大鼠心肌组织中肥大细胞均较少，主要散布于心肌间质纤维化灶中及血管周围。各组大鼠心肌中的肥大细胞数目（个/mm2）如下：SHR组：6.0±1.8；WKY组：1.2±0.8；Tel_H组：2.7±1.1；Tel_L组：5.1±1.5。SHR组心肌组织中肥大细胞明显多于WKY组（P<0.01），Tel_H组和Tel_L组肥大细胞少于SHR组（P<0.01）。见图3。
2.5 各组大鼠心肌组织中ICAM-1
ICAM-1在大鼠心肌组织中主要表达于动脉内皮、静脉内皮和心外膜。各组大鼠心肌中ICAM-1的IOD值分别为：SHR组305 689.90±26 728.19、WKY组78 241.02±7622.23，两组比较差异有统计学意义（P<0.01）；Tel_H组178 195.47±22 108.40、Tel_L组105 945.90±11 818.90。ICAM-1的表达SHR组明显多于WKY组（P<0.01），Tel_H组和Tel_L组都明显低于SHR组（P均<0.01）。见图4。
3 讨论
SHR属于多基因遗传性高血压动物模型。SHR出生后血压随鼠龄不断升高，4周龄时虽然血压正常但已出现心脏质量增加，3～4个月时为高血压确立期，6个月时血压达到最高水平，随后随血压升高进一步出现心血管并发症[9]。其病理生理机制与人类高血压疾病相似，普遍用于研究高血压疾病病理生理机制及筛选治疗高血压药物。本实验观察到30周龄的SHR发了明显的高血压，高剂量的替米沙坦可显著降低SHR的血压，低剂量对SHR的血压无明显降低作用。
高血压时可发生左心室肥厚，同时引起冠状动脉结构和功能的改变。研究发现血压时冠状动脉发生明显的重构，包括血管腔缩小，血管中膜厚度增并引起冠状动脉循环阻力增大，血流贮备及冠状动脉舒张能力降低[10]。我们早期的研究也发现30周龄的SHR发生了明显的心肌内小冠脉重构，表现为血管壁面积增大、管腔减小、IMSAs密度降低等[7]。本实验进一步观察到替米沙坦治疗可有效减轻SHR心肌内小冠脉的重构，而高剂量的替米沙坦较低剂量的替米沙坦对重构的改善更为明显。
已有研究发现高血压病患者外周血存在着单核细胞的激活[11-13]。左心室肥厚作为高血压的主要心脏损害是否也存在着炎症细胞的激活呢？本实验观察到相对于血压正常无血管重构的WKY大鼠，30周龄的SHR心肌组织中巨噬细胞、肥大细胞数量明显增多。提示炎症细胞也可能参与了高血压的血管重构过程。不论高剂量或低剂量，替米沙坦的治疗均可以明显减少心肌中浸润的巨噬细胞和肥大细胞数量。
研究发现，ICAM-l的异常表达涉及到多种心血管疾病。ICAM-1表达的增强与内皮的损害、内皮细胞功能的紊乱、高脂血症、肾素-血管紧张素系统的激活、细胞因子的作用、胰岛素抵抗等均有相关性[12，14-16]。本实验观察到SHR心肌中异常表达的ICAM-1主要在血管外膜及内皮，替米沙坦的治疗减轻ICAM-1的异常表达。
综上所述，本实验观察到30周龄SHR心肌内小冠脉发生明显重构，分析发现小冠脉的重构与心肌组织中的巨噬细胞、肥大细胞数量及ICAM-1的表达相关；替米沙坦治疗能明显减轻SHR心肌内小冠脉重构，减少心肌组织中的巨噬细胞、肥大细胞数量及ICAM-1的表达。 [参考文献]
[1] Androulakis E，Tousoulis D，Papageorgiou N，et al.Inflammation in hypertension：current therapeutic approaches[J].Curr Pharm Des，2011，17（37）：4121-4131.
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（收稿日期：2013-09-24）
[关键词] 自发性高血压大鼠；心肌内小冠脉重构；巨噬细胞；肥大细胞；细胞间粘附分子-1；替米沙坦
[中图分类号] R544.1 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2013）21-19-06
当前的研究认为高血压可能是一种慢性炎症性疾病[1]。在动物实验中发现，自发性高血压大鼠（SHR）体内存在着炎症细胞的激活，炎症细胞激活参与了左室肥厚等心血管重构过程[2-4]。Kubo等[5]观察到20周龄的SHR发生了冠状动脉重构，同时发现巨噬细胞在冠状动脉的浸润增多。在给予外源性血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导的高血压大鼠模型也了发现单核巨噬细胞在血管周围的浸润增多[6]。我们前期的研究发现30周龄自发性高血压大鼠血压显著升高，同时心肌内小冠脉（IMSAs）发生明显重构[7]。但IMSAs重构与炎症之间关系尚不明确。本研究探讨了SHR心肌内小冠脉重构与巨噬细胞、肥大细胞及细胞间粘附分子-1（ICAM-1）的关系，以及替米沙坦对SHR心肌内小冠脉重构及炎症影响的干预作用。
1 材料与方法
1.1 动物分组及干预
12周龄雄性自发性高血压大鼠（SHR）30只，体重250～300g，随机分为3组，每组均为10只，分别为无干预的高血压组（SHR组）、高剂量替米沙坦组（Tel_H组）和低剂量替米沙坦组（Tel_L组）。年龄、性别、体重与SHR相配对的WKY大鼠10只为正常血压、无干预对照组（WKY组）。Tel_L和Tel_H组分别按大鼠体重给予替米沙坦0.8mg/（kg·d）、8mg/（kg·d）溶解于2mL蒸馏水中，于每日上午8时灌胃；SHR组和WKY组予2mL蒸馏水每日上午8时灌胃。所有动物均购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，合格证书号：SCXK（沪2003-0003）。所有大鼠自由摄食、饮用冷开水，每12小时光照与黑暗循环交替。
1.2 试剂及仪器
羊抗大鼠细胞间粘附分子-1（ICAM-1）抗体冻干粉（克隆号：EWL1408，规格：1μg/mL）购自R&D Systems，Inc。鼠抗人巨噬细胞单克隆抗体浓缩液（CD68，1︰500，克隆号：ED1）、SP-9000免疫组化试剂盒和AEC显色剂购自北京中杉生物技术有限公司。替米沙坦（商品名：美卡素，国药准字J20040100），由德国勃林格殷格翰公司提供。RBP-1B型大鼠血压心率测定仪（北京中日友好医院临床研究所），BBX41显微镜（Olympus，Japan），计算机辅助图像分析系统（Image-Pro Plus 5.1）。
1.3 大鼠血压测定
在实验开始及结束时用RBP-1B型大鼠血压仪分别测量各组大鼠尾动脉收缩压（SBP）。每次测量3次，取平均值。
1.4 标本处理
大鼠饲养18周，至30周龄时结束实验。静脉内注射10%氯化钾2～3mL处死大鼠，迅速开胸取出心脏，10%PBS甲醛溶液固定20～30min后置于10%PBS甲醛中保存。所有心脏标本垂直左心室长轴从心尖部起连续切取3块组织块，常规石蜡包埋后，每个组织块做连续切片。
1.5 分析方法
行苦味酸-天狼猩红（Sirus-red）染色后，应用显微镜计算机辅助图像分析系统，选取内径10～150μm血管每切片计数8～10个，取平均值。依据Tanaka[8]介绍的方法对IMSAs壁横截面积（WA）、管腔面积（LA）及平均血管壁面积百分比（%WA）进行测定并计算。巨噬细胞应用ED1免疫组化染色，肥大细胞应用甲苯胺蓝染色，每张切片随机取10个视野，计算每平方毫米阳性细胞数（个/mm2）。ICAM-1应用免疫组化染色，每张切片随机取10个视野，在计算机图像分析系统下测定抗体积分光密度值（IOD）。 1.6 统计学处理
用SPSS13.0统计软件进行分析，所有实验数据以（）表示，组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）、LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组大鼠血压的变化
12周龄的SHR血压明显高于同龄WKY大鼠；30周龄时SHR组血压比WKY组明显升高，差异有统计学意义（P<0.01）；Tel_H组血压明显低于SHR组（P<0.01），而与WKY组无显著差异（P>0.05）；Tel_L组血压与SHR组相比无显著差异（P>0.05）。见表1。
2.2 各组大鼠IMSAs的重构
各组大鼠IMSAs的形态学变化（Sirus-red染色）见图1。（1）SHR组IMSAs与WKY组IMSAs相比，管壁面积及管腔面积百分比明显增高，管腔面积显著减小（P均<0.01）。（2）Tel_H组IMSAs与SHR组IMSAs相比，管壁面积与管腔面积百分比明显减小（P<0.01），而管腔面积增大（P>0.05）。Tel_H组IMSAs与WKY组IMSAs相比，管壁面积差异无统计学意义（P>0.05），管腔面积减小（P<0.01），而管腔面积百分比明显增大（P<0.01）。（3）Tel_L组IMSAs与SHR组IMSAs相比，管壁面积无明显差异（P>0.05），管腔面积与管腔面积百分比明显减小（P<0.01）；Tel_L组IMSAs与WKY组IMSAs相比，管壁面积与管腔面积百分比明显增高、管腔面积显著减小（P均<0.01）。（4）Tel_H组IMSAs与Tel_L组IMSAs相比，管壁面积与管腔面积百分比明显减小（P<0.01），管腔面积差异无统计学意义（P>0.05）。以上结果说明，30周龄SHR的IMSAs发生明显重构，管腔面积明显减小而管壁面积显著增大，因而管壁面积百分比增加更为显著。18周的替米沙坦治疗可抑制或逆转自发性高血压大鼠的心肌内小冠脉的重构，且高剂量的替米沙坦对小冠脉重构的减轻程度要强于低剂量的替米沙坦。见表2。
2.3 各组大鼠心肌中的巨噬细胞计数
大鼠心肌中的巨噬细胞主要分布在血管周围纤维化灶中和心外膜，多呈局灶性聚集。本实验计数血管周围巨噬细胞而排除心外膜下巨噬细胞。各组大鼠心肌中巨噬细胞（个/mm2）计数如下：SHR组：19.7±6.0；WKY组：5.3±3.2；Tel_H组：9.7±4.2；Tel_L组：14.5±5.7。SHR组巨噬细胞明显多于WKY组（P<0.01），Tel_H组和Tel_L组与SHR组相比巨噬细胞明显减少（P分别<0.05，0.01）。见图2。
2.4 各组大鼠心肌中的肥大细胞计数
各组大鼠心肌组织中肥大细胞均较少，主要散布于心肌间质纤维化灶中及血管周围。各组大鼠心肌中的肥大细胞数目（个/mm2）如下：SHR组：6.0±1.8；WKY组：1.2±0.8；Tel_H组：2.7±1.1；Tel_L组：5.1±1.5。SHR组心肌组织中肥大细胞明显多于WKY组（P<0.01），Tel_H组和Tel_L组肥大细胞少于SHR组（P<0.01）。见图3。
2.5 各组大鼠心肌组织中ICAM-1
ICAM-1在大鼠心肌组织中主要表达于动脉内皮、静脉内皮和心外膜。各组大鼠心肌中ICAM-1的IOD值分别为：SHR组305 689.90±26 728.19、WKY组78 241.02±7622.23，两组比较差异有统计学意义（P<0.01）；Tel_H组178 195.47±22 108.40、Tel_L组105 945.90±11 818.90。ICAM-1的表达SHR组明显多于WKY组（P<0.01），Tel_H组和Tel_L组都明显低于SHR组（P均<0.01）。见图4。
3 讨论
SHR属于多基因遗传性高血压动物模型。SHR出生后血压随鼠龄不断升高，4周龄时虽然血压正常但已出现心脏质量增加，3～4个月时为高血压确立期，6个月时血压达到最高水平，随后随血压升高进一步出现心血管并发症[9]。其病理生理机制与人类高血压疾病相似，普遍用于研究高血压疾病病理生理机制及筛选治疗高血压药物。本实验观察到30周龄的SHR发了明显的高血压，高剂量的替米沙坦可显著降低SHR的血压，低剂量对SHR的血压无明显降低作用。
高血压时可发生左心室肥厚，同时引起冠状动脉结构和功能的改变。研究发现血压时冠状动脉发生明显的重构，包括血管腔缩小，血管中膜厚度增并引起冠状动脉循环阻力增大，血流贮备及冠状动脉舒张能力降低[10]。我们早期的研究也发现30周龄的SHR发生了明显的心肌内小冠脉重构，表现为血管壁面积增大、管腔减小、IMSAs密度降低等[7]。本实验进一步观察到替米沙坦治疗可有效减轻SHR心肌内小冠脉的重构，而高剂量的替米沙坦较低剂量的替米沙坦对重构的改善更为明显。
已有研究发现高血压病患者外周血存在着单核细胞的激活[11-13]。左心室肥厚作为高血压的主要心脏损害是否也存在着炎症细胞的激活呢？本实验观察到相对于血压正常无血管重构的WKY大鼠，30周龄的SHR心肌组织中巨噬细胞、肥大细胞数量明显增多。提示炎症细胞也可能参与了高血压的血管重构过程。不论高剂量或低剂量，替米沙坦的治疗均可以明显减少心肌中浸润的巨噬细胞和肥大细胞数量。
研究发现，ICAM-l的异常表达涉及到多种心血管疾病。ICAM-1表达的增强与内皮的损害、内皮细胞功能的紊乱、高脂血症、肾素-血管紧张素系统的激活、细胞因子的作用、胰岛素抵抗等均有相关性[12，14-16]。本实验观察到SHR心肌中异常表达的ICAM-1主要在血管外膜及内皮，替米沙坦的治疗减轻ICAM-1的异常表达。
综上所述，本实验观察到30周龄SHR心肌内小冠脉发生明显重构，分析发现小冠脉的重构与心肌组织中的巨噬细胞、肥大细胞数量及ICAM-1的表达相关；替米沙坦治疗能明显减轻SHR心肌内小冠脉重构，减少心肌组织中的巨噬细胞、肥大细胞数量及ICAM-1的表达。 [参考文献]
[1] Androulakis E，Tousoulis D，Papageorgiou N，et al.Inflammation in hypertension：current therapeutic approaches[J].Curr Pharm Des，2011，17（37）：4121-4131.
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（收稿日期：2013-09-24）