猪链球菌核酸检测量值溯源研究及方法评估

来源 :国际流行病学传染病学杂志 | 被引量 : 0次 | 上传用户:zhouyonge
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针对病原微生物检测中急需解决的计量标准和量值溯源问题,建立猪链球菌核酸量值荧光定量PCR方法,研制猪链核酸检测标准物质,探索等效一致的核酸测量技术。方法根据已报告的DNA序列设计并合成种特异性16S rRNA引物,建立荧光定量PCR方法,摸索最佳上、下游引物配比浓度,利用已知核酸浓度的标准品作标准曲线并获得Ct值与样本起始拷贝数的关系,对方法的特异性、灵敏度、稳定性和不确定性进行评估,并进行DNA标准品效期实验。结果建立的猪链球菌DNA实时定量PCR方法,最佳引物浓度为上游0.6μmol/L,下游0.3μmol/L。方法的灵敏度为18.6 DNA拷贝数,DNA最佳检出浓度为1.86× 102~1.86× 104拷贝/10 μL反应体系。Ct值只与模板的DNA起始浓度有关(F= 597.60,P<0.01),与不同的实验时间及实验人员(F=0.60、1.90,P>0.05)无关。Ct值的不确定度为0.46%~5.40%。DNA标准品4℃可保存半年以上,而-60℃保存则可达1年以上。结论建立的荧光定量PCR方法特异性及稳定性良好,可用于猪链球菌核酸量值测定;制备的核酸标准物质具备国际计量标准,且稳定性好,可作为猪链球菌核酸检测的量值溯源和传递示范的标准物质。

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