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摘要[目的]研究小干松种源遗传多样性，为小干松引种、育种工作提供基础资料。[方法]利用SRAP荧光标记技术对引种的15个小干松种源进行SRAP分析。[结果]9对荧光标记的SRAP引物共产生1 075个条带，多态性位点953个，平均多态性为88.7%，每对引物扩增条带75～146条，平均每对引物扩增条带119条；通过UPGMA软件对15个种源进行遗传聚类分析，15个种源的相似系数在0.761 3～0.876 0，以遗传相似系数0.850 0为阈值可将15个种源分为4个群体，同一地理来源的种源有一定的遗传差异，但大体呈现按地理来源聚类的趋势。[结论]15个小干松种源具有较高的基因多态性，遗传多样性丰富，小干松变异类型与地理分布有关。
关键词小干松；种源；SRAP
中图分类号S188+.1文献标识码A文章编号0517-6611（2017）12-0139-02
Abstract[Objective] To study the gentic diversity of Pinus contorta provenance for laying the foundation for introduction of P. contorta breeding. [Method] Using SRAP fluorescence technique to analyze 15 provenances of P. contorta. [Result]9 SRAP primers for fluorescent labeling produced a total of 1 075 bands， 953 polymorphic loci， the average polymorphism was 88.7%. Each primer amplified bands were from 75 to 146， an average of 119 bands. The similarity coefficients of 15 provenances were 0.761 3-0.876 0 by UPGMA software.Taking the genetic similarity coefficient of 0.850 0 as threshold， 15 provenances were divided into 4 clusters， the provenances with the same geographic origin had some genetic differences， but generally showed a trend of clustering according to geographic origin. [Conclusion]15 provenances of P. contorta had high genetic diversity， abundant genetic diversity， the variation types were related to geographic distribution.
Key wordsPinus contorta；Provenances；SRAP
小干松（Pinus contorta）為松科松属植物，原产地为北美，具有良好的抗性和适应性 [1]。SRAP标记（SequenceRelated Amplified Polymorphism）是由Li 等[2]在2001年提出的一种基于PCR的分子标记技术。该方法具有高共显、中产率、多态性高和重复性好的特点，已被广泛应用在遗传多样性分析、遗传图谱构建和基因定位、基因分离、品种鉴定等研究中。该研究采用SRAP技术对引进的不同种源小干松进行遗传多样性分析，旨在为小干松的引种、育种工作提供基础资料。
1材料与方法
1.1材料
供试材料为从加拿大引进的15个种源小干松种子（表1）。将其播种于辽宁省清原满族自治县国营大孤家林场，繁育家系，每个种源采10 株不同健康单株上当年生新发针叶，液氮冻存后放于-80 ℃冰箱保存备用。
1.2方法
1.2.1DNA的提取。采用CTAB法（稍加改进）提取小干松基因组DNA [3]。0.8%琼脂糖凝胶电泳检测提取DNA 的质量及完整性，UV1102 紫外分光光度计测定 DNA 浓度，在-20 ℃条件下保存备用。
1.2.2
PCR反应。将每个种源的10个家系基因组DNA按相同浓度混合作为模板。荧光标记引物由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司合成。从64对引物组合（表2）中，选择多态性好的9对进行扩增，反应总体积为20 μL，包括：Taq酶0.5 U，Mg2+浓度2.5 mmol/L，dNTPs浓度0.15 mmol/L，模板DNA含量60 ng，引物0.2 μmol/L。Mg2+、10×PCR Buffer 和 Taq 酶均购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。扩增反应在 PTC-200 型 PCR（BIO-RAD）上进行，扩增程序为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，35 ℃复性1 min，72 ℃延伸1 min，5个循环；94 ℃变性1 min，50 ℃复性1 min，72 ℃延伸1 min，35个循环；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR 产物用4%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，ABI377测序仪检测片段大小，生成胶图。
1.3数据统计与分析
通过GeneScan软件对胶图进行分析，有带的地方替换为1，无带的地方替换为0，这样构成了0/1数据，利用 NTsys 2.10软件进行 UPGMA聚类分析并绘制树状聚类图。
2结果与分析 2.1小干松种源遗传多样性的SRAP分析
从64对SRAP引物中选取9对扩增产物多态性好、谱带清晰的引物进行 PCR 扩增，对15个小干松种源进行SRAP分析，电泳图谱见〖CM（25〗图1。这9对引物共扩增出 1〖KG*2〗075个条带，平均每对引物可以扩增出 119条带，检测出多态性条带为953 条，平均多态性为88.7%（表3）。
2.2小干松种源相似性和聚类分析
采用软件NTSYS 2.10，根据9对引物产生的全部位点进行遗传相似系数的计算，15个种源相似系数在0.761 3～0.876 0（表4）。利用UPGMA法进行聚类分析得到15个小干松种源的聚类树形（图2），以相似系数0.850 0为阈值，将15个种源分为4个群体：种源C1、C2、C3、C5、C13和C15为第一群体；种源C14为第二群体；种源C4、C6、C7和C10为第三群体；种源C8、C9、C11和C12为第四群体。
3讨论与结论
小干松具有适应性强、生长快的特点，并且抗旱、抗虫性较强，我国的黑龙江、吉林、湖北等地均进行了引种，并进行了一系列的种源试验，发现小干松树高、胸径等指标在种源间差异显著[4-6]，说明不同种源的小干松遗传变异较高。
该研究用荧光标记SRAP方法分析了从加拿大引进的15个小干松种源的遗传差异，共得到1 075个条带，检测出多态性条带为953 条，平均多态性为88.7%，多态性较高，说明荧光标记的SRAP适合分析小干松种源的遗传多样性。15个种源遗传距离在0.238 7～0.124 0，相似系数比较高，可能是由于引种地理位置较近所致。
参考文献
[1] 宋晓东.抗旱耐寒国外松的选择[J].辽宁林业科技，1994（2）：9-13.
[2] LI G，QURIOS C F.Sequencerelated amplified polymorphism（SRAP），a new marker system based on a simple PCR reaction：Its application to mapping and gene tagging in Brassica[J].Theor Appl Genet，2001，103（8）：455 - 461.
[3] WANG X D，WANG Z P，ZOU Y P.An improved procedure for the isolation of nuclear DNA from leaves of wild grapevine dried with silicagel[J].Plant Mol Biol Rep，1996，14（4）：369-373.
[4] 黃登民，王生，周显昌.小干松引种实验初报[J].延边大学农学学报，2003，25（1）：13-15.
[5] 陆志民，时樱，吴为群，等.小干松种源实验与研究[J].吉林林业科技，1994（5）：41-49.
[6] 谢祖年，章定清，范亦，等.小干松引种与种源试验[J].林业科技开发，2000，14（4）：40-42.
关键词小干松；种源；SRAP
中图分类号S188+.1文献标识码A文章编号0517-6611（2017）12-0139-02
Abstract[Objective] To study the gentic diversity of Pinus contorta provenance for laying the foundation for introduction of P. contorta breeding. [Method] Using SRAP fluorescence technique to analyze 15 provenances of P. contorta. [Result]9 SRAP primers for fluorescent labeling produced a total of 1 075 bands， 953 polymorphic loci， the average polymorphism was 88.7%. Each primer amplified bands were from 75 to 146， an average of 119 bands. The similarity coefficients of 15 provenances were 0.761 3-0.876 0 by UPGMA software.Taking the genetic similarity coefficient of 0.850 0 as threshold， 15 provenances were divided into 4 clusters， the provenances with the same geographic origin had some genetic differences， but generally showed a trend of clustering according to geographic origin. [Conclusion]15 provenances of P. contorta had high genetic diversity， abundant genetic diversity， the variation types were related to geographic distribution.
Key wordsPinus contorta；Provenances；SRAP
小干松（Pinus contorta）為松科松属植物，原产地为北美，具有良好的抗性和适应性 [1]。SRAP标记（SequenceRelated Amplified Polymorphism）是由Li 等[2]在2001年提出的一种基于PCR的分子标记技术。该方法具有高共显、中产率、多态性高和重复性好的特点，已被广泛应用在遗传多样性分析、遗传图谱构建和基因定位、基因分离、品种鉴定等研究中。该研究采用SRAP技术对引进的不同种源小干松进行遗传多样性分析，旨在为小干松的引种、育种工作提供基础资料。
1材料与方法
1.1材料
供试材料为从加拿大引进的15个种源小干松种子（表1）。将其播种于辽宁省清原满族自治县国营大孤家林场，繁育家系，每个种源采10 株不同健康单株上当年生新发针叶，液氮冻存后放于-80 ℃冰箱保存备用。
1.2方法
1.2.1DNA的提取。采用CTAB法（稍加改进）提取小干松基因组DNA [3]。0.8%琼脂糖凝胶电泳检测提取DNA 的质量及完整性，UV1102 紫外分光光度计测定 DNA 浓度，在-20 ℃条件下保存备用。
1.2.2
PCR反应。将每个种源的10个家系基因组DNA按相同浓度混合作为模板。荧光标记引物由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司合成。从64对引物组合（表2）中，选择多态性好的9对进行扩增，反应总体积为20 μL，包括：Taq酶0.5 U，Mg2+浓度2.5 mmol/L，dNTPs浓度0.15 mmol/L，模板DNA含量60 ng，引物0.2 μmol/L。Mg2+、10×PCR Buffer 和 Taq 酶均购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。扩增反应在 PTC-200 型 PCR（BIO-RAD）上进行，扩增程序为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，35 ℃复性1 min，72 ℃延伸1 min，5个循环；94 ℃变性1 min，50 ℃复性1 min，72 ℃延伸1 min，35个循环；最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR 产物用4%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，ABI377测序仪检测片段大小，生成胶图。
1.3数据统计与分析
通过GeneScan软件对胶图进行分析，有带的地方替换为1，无带的地方替换为0，这样构成了0/1数据，利用 NTsys 2.10软件进行 UPGMA聚类分析并绘制树状聚类图。
2结果与分析 2.1小干松种源遗传多样性的SRAP分析
从64对SRAP引物中选取9对扩增产物多态性好、谱带清晰的引物进行 PCR 扩增，对15个小干松种源进行SRAP分析，电泳图谱见〖CM（25〗图1。这9对引物共扩增出 1〖KG*2〗075个条带，平均每对引物可以扩增出 119条带，检测出多态性条带为953 条，平均多态性为88.7%（表3）。
2.2小干松种源相似性和聚类分析
采用软件NTSYS 2.10，根据9对引物产生的全部位点进行遗传相似系数的计算，15个种源相似系数在0.761 3～0.876 0（表4）。利用UPGMA法进行聚类分析得到15个小干松种源的聚类树形（图2），以相似系数0.850 0为阈值，将15个种源分为4个群体：种源C1、C2、C3、C5、C13和C15为第一群体；种源C14为第二群体；种源C4、C6、C7和C10为第三群体；种源C8、C9、C11和C12为第四群体。
3讨论与结论
小干松具有适应性强、生长快的特点，并且抗旱、抗虫性较强，我国的黑龙江、吉林、湖北等地均进行了引种，并进行了一系列的种源试验，发现小干松树高、胸径等指标在种源间差异显著[4-6]，说明不同种源的小干松遗传变异较高。
该研究用荧光标记SRAP方法分析了从加拿大引进的15个小干松种源的遗传差异，共得到1 075个条带，检测出多态性条带为953 条，平均多态性为88.7%，多态性较高，说明荧光标记的SRAP适合分析小干松种源的遗传多样性。15个种源遗传距离在0.238 7～0.124 0，相似系数比较高，可能是由于引种地理位置较近所致。
参考文献
[1] 宋晓东.抗旱耐寒国外松的选择[J].辽宁林业科技，1994（2）：9-13.
[2] LI G，QURIOS C F.Sequencerelated amplified polymorphism（SRAP），a new marker system based on a simple PCR reaction：Its application to mapping and gene tagging in Brassica[J].Theor Appl Genet，2001，103（8）：455 - 461.
[3] WANG X D，WANG Z P，ZOU Y P.An improved procedure for the isolation of nuclear DNA from leaves of wild grapevine dried with silicagel[J].Plant Mol Biol Rep，1996，14（4）：369-373.
[4] 黃登民，王生，周显昌.小干松引种实验初报[J].延边大学农学学报，2003，25（1）：13-15.
[5] 陆志民，时樱，吴为群，等.小干松种源实验与研究[J].吉林林业科技，1994（5）：41-49.
[6] 谢祖年，章定清，范亦，等.小干松引种与种源试验[J].林业科技开发，2000，14（4）：40-42.