目前,PCR引物设计主要依赖于软件对引物熔点的模拟计算,而PCR退火条件的优化需进行不同条件下的扩增实验。为开发一种可高效、精确评价引物和确定退火条件的方法,本研究采用高分辨率熔解曲线(high resolution melting,HRM)测定技术直接分析短链DNA的熔点,用于引物优劣性的评价,并为退火条件的优化提供参考。本文用HRM法直接测定了非完全互补的双链DNA以及DNA发卡结构的熔点,结果显示:(1)与完全互补的双链DNA相比,较为稳定的单碱基错配A獉G、G獉G和T獉G的熔点只降低2℃~3℃,部分双碱基错配的熔点只降低4℃~6℃,单碱基突出熔点只降低4℃~5℃。因此,如果采用的退火温度不当,部分错配的非目的模板可能会被扩增。(2)即使发卡结构的茎干区只有6 bp,当其环区碱基少于10 nt时,其熔点也可达到60℃以上。此外,环区的长度对发卡熔点也有较大影响。根据本研究结果发现,引物设计时应尽量避免模板引物结合区同其邻近的30 nt碱基有6 bp以上的互补部分。综上所述,本研究证明HRM熔点法是一种高效评价引物及确定退火温度的方法。