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构建肺炎链球菌ciaH基因敲除(ΔciaH)突变株，了解肺炎链球菌二元信号系统CiaH/CiaR中ciaH基因与β-内酰胺类抗生素耐药的相关性。
方法采用PCR扩增肺炎链球菌ATCC6306株ciaH基因片段，T-A克隆后测序。构建用于敲除ciaH基因的自杀质粒pEVP3ciaH，CaCl2法将其转化入肺炎链球菌ATCC6306株，通过同源重组、插入失活及氯霉素筛选获得肺炎链球菌ATCC6306株ciaH基因敲除突变株ΔciaH。采用PCR、测序及激光共聚焦显微镜法对ΔciaH突变株进行鉴定。采用二倍琼脂稀释法测定并比较青霉素G(PCN)或头孢噻肟(CTX)对ΔciaH突变株和野生株最低抑菌浓度(MIC)及其差异。采用实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)检测1/4 MIC PCN或CTX作用前后ciaH-mRNA水平变化。
结果PCR和测序结果显示，所构建的ΔciaH突变株染色体DNA中ciaH基因被插入失活；免疫荧光法检测结果显示，ΔciaH突变株不表达CiaH蛋白。PCN和CTX对ΔciaH突变株MIC分别为32 μg/ml和64 μg/ml，明显高于野生株的0.06 μg/ml和1 μg/ml(P<0.01)。1/4 MIC PCN或CTX作用后，肺炎链球菌ciaH-mRNA水平显著升高(P<0.01)。
结论肺炎链球菌CiaH/CiaR二元信号系统中CiaH与其对β-内酰胺类抗生素耐药性有关。