秀丽兜兰（Paphiopedilum venustum）具有较高的观赏价值和保护生物学价值，野外资源濒临灭绝，叶绿体基因组（cpDNA）具有基因组小、结构稳定、高度的保守性等优点被广泛用于植物系统发育和物种鉴定，了解秀丽兜兰的叶绿体基因组结构，对揭示兜兰属植物的系统进化关系具有重要意义。本研究通过二代高通量测序技术获得秀丽兜兰叶绿体全基因组序列，利用GeSeq、blast和hmmer软件对叶绿体基因组进行注释，采用MISA、CodonW、fasttree等生物信息学软件对其基因组结构、基因数目、序列重复、密码子偏好性和系统发育进行分析。结果表明：秀丽兜兰叶绿体基因组结构保守，具有典型的环状四分体结构，一对反向重复区（IRs）将大单拷贝区（LSC）和小单拷贝区（SSC）分开，全长158 298bp，GC含量为35.4%，共注释得到129个基因，包括79个蛋白编码基因，38个tRNA基因、8个rRNA基因和4个假基因；检测到78个SSR位点，以单核苷酸重复和二核苷酸重复为主，分别占比84.62%和10.26%，没有五核苷酸重复，并且大多由A或T构成；确定了高频密码子32个，90.6%都以A或U结尾，编码亮氨酸（Leu）的密码子使用频率最高，而编码半胱氨酸（Cys）的密码子使用频率最低。通过比较18个兰科植物叶绿体基因组，构建系统进化树发现，紫花杓兰和西藏杓兰这两个杓兰属植物被单独聚成一支，兜兰属被分成两大类，其中秀丽兜兰（P. venustum）与同属的紫纹兜兰（P. purpuratum）亲缘关系密切。本研究筛选出的SSR和核苷酸多态性能够作为兜兰属植物种质鉴定和遗传多样性的分子标记，可为珍稀濒危植物秀丽兜兰及其近缘种的种质鉴定、系统发育等提供理论依据，为兜兰属植物种群恢复、生物多样性保护、创新利用及新品种选育奠定基础。