论文部分内容阅读
摘要
马铃薯干腐病是马铃薯最重要的贮藏期病害之一，现已成为马铃薯贮藏期烂窖的重要原因。实现病原菌的快速检测对病害诊断和科学防控具有重要的实践意义。本研究基于镰刀菌翻译延伸因子序列设计了一对检测接骨木镰刀菌Fusarium sambucinum的特异引物FsF/FsR。该特异引物可从接骨木镰刀菌中获得309 bp的特异性扩增片段，而其他种类镰刀菌及马铃薯重要病害病原菌中均无此片段，说明该引物具有专一性。该体系的灵敏度检测结果表明，最低能检测到的接骨木镰刀菌基因组DNA浓度为70 pg/μL。该引物也适用于发病马铃薯块茎中接骨木镰刀菌的快速检测。
关键词
马铃薯干腐病；镰刀菌；分子检测；接骨木镰刀菌
中图分类号：
S 435.32
文献标识码：A
DOI：10.3969/j.issn.05291542.2017.04.021
Abstract
Potato dry rot， caused by various Fusarium spp.， is one of the most important storage diseases of potato. This disease became a main reason of rotten potatoes in the storage cavern. Rapid detection of the pathogen has the important practical significance for disease diagnosis and scientific prevention and control. In this study， based on the translation elongation factor1 alpha （TEF1α） sequences of Fusarium， a specific pair of primers FsF/FsR for F.sambucinum was designed. Using FsF/FsR， PCR product with the length of 309 bp was amplified only from F.sambucinum， but not other Fusarium spp. and pathogens causing potato important diseases. The detection sensitivity for genomic DNA was 70 pg/μL.This method can be used to detect F.sambucinum in potato tubers.
Key words
potato dry rot；Fusarium；molecular detection；Fusarium sambucinum
由多种镰刀菌引起的马铃薯干腐病是马铃薯贮藏期重要病害之一，其常年发病率为10%～30%[1]，最高可达60%以上[2]，现已成为马铃薯产业进一步发展的瓶颈。因此，寻找快速、准确的干腐病菌的分子检测技术对干腐病的诊断和科学防治具有重要意义。形态学鉴定是传统的镰刀菌鉴定方法，然而，由于镰刀菌的分类系统繁多复杂，并且温湿度、光照、pH等环境条件的改变都会导致其培养性状发生明显变化[3]，加之形态鉴定本身比较耗时耗力，因此，镰刀菌的鉴定面临着巨大挑战。近年来，随着分子生物学的发展，特别是GenBank核酸序列数据库中真菌序列的不断丰富为镰刀菌的准确、快速鉴定开辟了新的方向。
国内外关于马铃薯干腐病菌的分子检测研究较少。2006年，Atallah等[4]应用实时荧光定量PCR对引起马铃薯块茎腐烂的5种病原菌进行了检测和定量，文中利用β微管蛋白（βtubulin）基因设计了一对检测接骨木镰刀菌F.sambucinum的引物，该引物可以成功检测到该菌，但也可扩增出燕麦镰刀菌F.avenaceum、黄色镰刀菌F.culmorum、禾谷镰刀菌F.graminearum和锐顶镰刀菌F.acuminatum等病原菌。2005年，Cullen等[5]通过实时荧光定量PCR和PCR酶联免疫吸附测定的方法对引起马铃薯干腐病的F.avenaceum、深蓝镰刀菌F.coeruleum、F.culmorum和硫色镰刀菌F.sulphureum进行了分子检测，通过ITS序列比对，利用其中具有差异的区域设计了针对F.coeruleum和F.sulphureum的特異性引物。而对于F.avenaceum和F.culmorum，由于ITS序列在这两个种间的差异不大，因此不能用该片段设计引物，为此，Cullen等分别利用Turner等[6]和Nicholson等[7]针对F.avenaceum和F.culmorum设计的引物进行试验，结果均成功地检测到相应的镰刀菌。2013年，李瑞琴等[8]通过ITS序列比对，设计了针对F.sambucinum和F.solani的特异性引物，并检测了这两种病原菌在连作马铃薯根际的动态变化。
事实上，虽然前人将ITS序列用于镰刀菌分类研究并取得了一定的结果，但关于ITS是否真正适用于镰刀菌的分类鉴定仍存在许多争议。YliMattila等[9]用通用引物扩增梨孢镰刀菌F.poae、F.langsethiae、拟枝孢镰刀菌F.sporotrichioides和九州镰刀菌F.kyushuense的ITS、IGS、βtubulin片段，UPPCR杂交的结果表明：ITS不能完全地区分这4个种，而βtubulin可用于种水平上的鉴定，IGS在亚种水平具有多样性。在这之后，Kvas等[10]对镰刀菌遗传演化多样性的研究进行了概述，认为一些镰刀菌，尤其是有性态属于赤霉属的镰刀菌，其ITS2区域存在非同源拷贝，致使其不能真实准确地用于镰刀菌分类，而28S rRNA、线粒体小亚基（mtSSU）、βtubulin、组蛋白3、钙调蛋白和翻译延伸因子（TEF1α）可以用来鉴定镰刀菌。其他研究也论证了TEF1α是在种的水平上信息量很高的单拷贝基因，利用TEF1α基因序列设计得到的引物非常适用于镰刀菌属种的鉴定[1112]。 本研究利用镰刀菌属TEF1α序列设计特异性引物，可为马铃薯干腐病菌的优势种群F.sambucinum的准确鉴定和快速检测提供技术和方法。对病害进行快速检测可及时淘汰病薯，对于减少因干腐病造成的损失具有重要意义。
1材料与方法
1.1供试菌株
本研究中供试菌株种名、寄主、来源相关信息见表1。
1.2菌丝基因组DNA的提取
取少量培养好的菌丝，采用CTAB法[13]提取DNA，加适量灭菌超纯水（含20 μg/mL RNase）溶解DNA，37℃处理1 h后，-20℃保存备用。
1.3马铃薯发病组织DNA的快速提取
马铃薯块茎发病组织DNA提取采用改进的玻璃珠振荡法[14]：用灭菌解剖刀切取接种接骨木镰刀菌后发病马铃薯块茎的病健交界处，放入1.5 mL离心管中，加入适量石英砂，再加入500～800 μL微量粗提取缓冲液TE，用台钻充分研磨，将离心管在漩涡仪上大于2 000 r/min振荡5 min。常温下，14 000 r/min离心10 min，吸取上清液直接用于PCR扩增，或将含有DNA的上清液保存于-20℃条件下备用。
1.4特异引物设计
从GenBank中下载镰刀菌属TEF1α基因的所有序列。用ClustalX 1.81[15]对下载序列进行比对，并用BioEdit 7.0.1[13]进行人工调整，通过DAMBE 4.2.13[16]保留一条碱基完全相同而名称不同的序列作为该单倍型的代表序列，最终所有保留的单倍型构成镰刀菌属TEF1α序列的数据组。对该数据组进行分析，找出各个种内保守而种间差异较大的变异区，设计接骨木镰刀菌的特异引物，并用GenBank中primerBLAST检测引物的特异性。引物由北京天一辉远生物科技有限公司合成。
1.5引物特异性检测
用特异性引物FsF/FsR对接骨木镰刀菌、其他镰刀菌以及马铃薯重要病害病原菌进行PCR扩增，以ddH2O为阴性对照。PCR反应体系为25 μL，其中，DNA模板1 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。扩增程序为：94℃ 4 min；94℃ 40 s，61℃ 40 s，72℃ 20 s，28个循环；72℃ 7 min；4℃保存。扩增完毕，取5 μL扩增产物于1%琼脂糖凝胶进行电泳检测。
1.6引物灵敏度检测
使用紫外分光光度计测量接骨木镰刀菌基因组DNA浓度，采用10倍梯度稀释法，将提取的基因组DNA从700 ng/μL逐级稀释为70 fg/μL 8个不同浓度梯度。应用特异性引物FsF/FsR，利用1.5中的PCR反应体系、反应程序，以稀释的各个浓度的DNA为模板进行扩增，确定该PCR体系能检测到接骨木镰刀菌的最低浓度。
1.7马铃薯发病组织的快速检测
马铃薯干腐病的人工接种参考Choiseul等[17]的伤口接种法。将大小一致的健康马铃薯薯块先后用自来水和无菌水清洗干净之后用75%乙醇表面消毒，自然晾干待用。用直径5 mm的打孔器在薯块上打取3 mm深的3个小孔，将在PDA平板上培养7 d、直径为5 mm的HW114菌饼接种于小孔中，再将原薯块组织轻轻塞回。共接种10个薯块，另接种无菌PDA培养基圆片为对照。接种薯块置于保湿装置内，25℃恒温培养。
用灭菌解剖刀切取接种接骨木镰刀菌后发病马铃薯块茎的病健交界处，提取DNA，以健康块茎及接种无菌水的块茎为对照，利用1.5建立的检测体系，对马铃薯干腐病发病组织进行检测。
2结果与分析
2.1接骨木镰刀菌特异引物的确定
从GenBank上共下载镰刀菌属TEF1α序列2 468条，对其进行比对、删除重复序列、人工调整，最终剩余632条。分析找出了接骨木镰刀菌种内保守而与其他镰刀菌种间差异较大的序列区域，设计了种专一性的引物对FsF/FsR（FsF：5′GACCCAAATCTAAGCTCGCC3′；FsR：5′GAAGGGCATGTCGCTCAAG3′）。该引物扩增片段长度为309 bp。用GenBank中primerBLAST检测引物的特异性，发现设计的引物序列仅能与GenBank中接骨木镰刀菌的TEF1α序列完全匹配，表明引物FsF/FsR是特异的。
2.2引物FsF/FsR特异性检测
利用特异性引物FsF/FsR对接骨木镰刀菌、本研究分离的另外3种干腐病菌、其他作物上的镰刀菌、马铃薯晚疫病菌、黑痣病菌及早疫病菌进行了PCR扩增。结果表明：该引物从接骨木镰刀菌中均可扩增出309 bp的特异性条带，而其他菌株和ddH2O对照均未扩增出任何条带（图1），表明该引物具有很高的特异性，能够用于接骨木镰刀菌的快速分子鉴定。
2.3引物FsF/FsR对接骨木镰刀菌分子检测的灵敏度
供试接骨木镰刀菌基因组DNA的浓度为700 ng/μL。通过10倍梯度稀释法稀释DNA，得到8个浓度梯度，即700 ng/μL、70 ng/μL、7 ng/μL、700 pg/μL、70 pg/μL、7 pg/μL、700 fg/μL和70 fg/μL。利用1.5中的PCR体系和程序检测特异引物扩增的灵敏度。结果表明，该PCR反应能检测的最低DNA濃度为70 pg/μL（图2）。
2.4发病薯块中病原菌的分子检测
人工接种接骨木镰刀菌后，对发病薯块进行PCR扩增。被侵染的薯块组织中可以检测到接骨木镰刀菌，在309 bp处出现特异性条带，而健康薯块和接种无菌水的薯块中均无该特异性条带（图3），证明该方法可以准确地检测出引起马铃薯干腐病的接骨木镰刀菌。 3讨论
TEF1α是在种水平上信息量很高的单拷贝基因，适用于镰刀菌种的鉴定[1112]。本研究基于镰刀菌TEF1α序列设计的接骨木镰刀菌的特异引物FsF/FsR，通过普通PCR对接骨木镰刀菌基因组DNA检测的最低浓度为70 pg/μL。这比陈恩发[18]利用普通PCR检测接骨木镰刀菌的灵敏度（196.35 pg/μL）高，但比实时荧光定量PCR的灵敏度（19.635 pg/μL）稍低。在引物设计时发现，与接骨木镰刀菌亲缘关系最近的是F.venenatum。
1995年，Nirenberg[19]报道了在马铃薯上分离得到了F.venenatum，本研究设计的引物恰好选取在这两种镰刀菌的差异区，并且F.venenatum主要危害大麦和小麦[20]，因此，近缘种F.venenatum对马铃薯上接骨木镰刀菌的检测无影响。
陈恩发[18]根据不同镰刀菌TEF1α序列设计了一对引物，该引物可检测出马铃薯干腐病主要致病菌，扩增片段为147～170 bp，但文中仅提供了接骨木镰刀菌的扩增片段为168 bp，而对供试的尖孢镰刀菌、锐顶镰刀菌、木贼镰刀菌和燕麦镰刀菌并未说明扩增片段，也未叙述上述4种镰刀菌的具体检测结果。此外，同一对引物对5个镰刀菌种类扩增仅存在23 bp的差异，无论是利用普通PCR还是实时定量PCR进行检测，均会因为片段差异过小而不能很好地分辨各个种类。同样，Atallah等[4]应用实时荧光定量PCR对5种干腐病菌进行了检测和定量，利用β微管蛋白基因设计了一对检测接骨木镰刀菌的引物，可以成功检测到该菌，但同时该引物也可扩增出其他4种镰刀菌。由于不同种类的镰刀菌的生物学特性和对药剂的敏感性不同，因此针对不同镰刀菌所制定的防治方案也不完全相同，不能准确区分每种镰刀菌，就不能为干腐病防治提供科学的理论依据。本研究建立的分子检测方法能特异地检测接骨木镰刀菌，而其他干腐病菌不能被检出。因此，本试验建立的分子检测技术可以经济、准确、快速地检测到接骨木镰刀菌，为病害的诊断及科学防治提供理论依据。
参考文献
[1]于俊琴. 马铃薯种薯贮藏期间干腐病的发生及防治措施[J]. 天津农林科技， 2002（4）： 9.
[2]Wharton P， Hammerschmidt R， Kirk W.Fusarium dry rot [M]. Michigan State University Extension， 2007.
[3]Rout M K， Mohapatra K B， Swain S K. Effect of environmental parameters on growth of three pathogenic fungi of groundnut [J]. Environment and Ecology， 2012， 30（3B）： 935937.
[4]Atallah Z K， Stevenson W R.A methodology to detect and quantify five pathogens causing potato tuber decay using realtime quantitative polymerase chain reaction [J]. Phytopathology， 2006， 96（9）： 10371045.
[5]Cullen D W， Toth I K， Pitkin Y， et al. Use of quantitative molecular diagnostic assays to investigate Fusarium dry rot in potato stocks and soil [J]. Phytopathology， 2005， 95（12）： 14621471.
[6]Turner A S， Lees A K， Rezanoor H N， et al. Refinement of PCRdetection of Fusarium avenaceum and evidence from DNA marker studies for phenetic relatedness to Fusarium tricinctum [J]. Plant Pathology，1998， 47（3）： 278288.
[7]Nicholson P， Simpson D R， Weston G， et al. Detection and quantification of Fusarium culmorum and Fusarium graminearum in cereals using PCR assays [J]. Physiological and Molecular Plant Pathology， 1998， 53（1）： 1737.
[8]李瑞琴，劉星，邱慧珍，等. 连作马铃薯根际干腐病优势病原菌荧光定量PCR快速检测及在根际的动态变化[J]. 草业科学， 2013， 22（6）： 239248.
[9]YliMattila T， Mach R， Alekhina I A， et al. Phylogenetic relationship of Fusarium langsethiae to Fusarium poae and Fusarium sporotrichioides as inferred by IGS， ITS， βtubulin sequences and UPPCR hybridization analysis [J]. International Journal of Food Microbiology， 2004， 95（3）：267285. [10]Kvas M， Marasas W F O， Wingfield B D， et al. Diversity and evolution of Fusarium species in the Gibberella fujikuroi complex [J]. Fungal Diversity， 2009， 34： 121.
[11]Knutsen A K， Torp M， HolstJensen A.Phylogenetic analyses of the Fusarium poae， Fusarium sporotrichioides and Fusarium langsethiae species complex based on partial sequences of the translation elongation factor1 alpha gene [J]. International Journal of Food Microbiology， 2004， 95（3）： 287295.
[12]Geiser D M， del Mar JimenezGasco M， Kang S， et al. FUSARIUMID v. 1.0： a DNA sequence database for identifying Fusarium [J].European Journal of Plant Pathology，2004，110（5）：473479.
[13]Pipe N D， Azcoitia V， Shaw D S.Selffertility in Phytophthora infestans： heterokaryons segregate several phenotypes [J]. Mycological Research， 2000， 104（6）： 676680.
[14]李海娟，孫银银，权军利，等. 快速粗提取致病疫霉菌菌丝DNA的方法[J]. 北方园艺， 2010（17）： 168170.
[15]Thompson J D， Gibson T J， Plewniak F， et al. The Clustal_X windows interface： flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools [J]. Nucleic Acids Research， 1997， 25（24）： 48764882.
[16]Xia X， Xie Z. DAMBE： software package for data analysis in molecular biology and evolution[J]. Journal of Heredity， 2001， 92（4）： 371373.
[17]Choiseul J， Allen L， Carnegie S F.Fungi causing dry tuber rots of seed potatoes in storage in Scotland [J]. Potato Research， 2007， 49（4）： 241253.
[18]陈恩发. 多重实时定量PCR检测马铃薯主要的真细菌病原菌[D]. 呼和浩特： 内蒙古大学， 2011.
[19]Nirenberg H I. Morphological differentiation of Fusarium sambucinum Fuckel sensu stricto， F.torulosum （Berk.
马铃薯干腐病是马铃薯最重要的贮藏期病害之一，现已成为马铃薯贮藏期烂窖的重要原因。实现病原菌的快速检测对病害诊断和科学防控具有重要的实践意义。本研究基于镰刀菌翻译延伸因子序列设计了一对检测接骨木镰刀菌Fusarium sambucinum的特异引物FsF/FsR。该特异引物可从接骨木镰刀菌中获得309 bp的特异性扩增片段，而其他种类镰刀菌及马铃薯重要病害病原菌中均无此片段，说明该引物具有专一性。该体系的灵敏度检测结果表明，最低能检测到的接骨木镰刀菌基因组DNA浓度为70 pg/μL。该引物也适用于发病马铃薯块茎中接骨木镰刀菌的快速检测。
关键词
马铃薯干腐病；镰刀菌；分子检测；接骨木镰刀菌
中图分类号：
S 435.32
文献标识码：A
DOI：10.3969/j.issn.05291542.2017.04.021
Abstract
Potato dry rot， caused by various Fusarium spp.， is one of the most important storage diseases of potato. This disease became a main reason of rotten potatoes in the storage cavern. Rapid detection of the pathogen has the important practical significance for disease diagnosis and scientific prevention and control. In this study， based on the translation elongation factor1 alpha （TEF1α） sequences of Fusarium， a specific pair of primers FsF/FsR for F.sambucinum was designed. Using FsF/FsR， PCR product with the length of 309 bp was amplified only from F.sambucinum， but not other Fusarium spp. and pathogens causing potato important diseases. The detection sensitivity for genomic DNA was 70 pg/μL.This method can be used to detect F.sambucinum in potato tubers.
Key words
potato dry rot；Fusarium；molecular detection；Fusarium sambucinum
由多种镰刀菌引起的马铃薯干腐病是马铃薯贮藏期重要病害之一，其常年发病率为10%～30%[1]，最高可达60%以上[2]，现已成为马铃薯产业进一步发展的瓶颈。因此，寻找快速、准确的干腐病菌的分子检测技术对干腐病的诊断和科学防治具有重要意义。形态学鉴定是传统的镰刀菌鉴定方法，然而，由于镰刀菌的分类系统繁多复杂，并且温湿度、光照、pH等环境条件的改变都会导致其培养性状发生明显变化[3]，加之形态鉴定本身比较耗时耗力，因此，镰刀菌的鉴定面临着巨大挑战。近年来，随着分子生物学的发展，特别是GenBank核酸序列数据库中真菌序列的不断丰富为镰刀菌的准确、快速鉴定开辟了新的方向。
国内外关于马铃薯干腐病菌的分子检测研究较少。2006年，Atallah等[4]应用实时荧光定量PCR对引起马铃薯块茎腐烂的5种病原菌进行了检测和定量，文中利用β微管蛋白（βtubulin）基因设计了一对检测接骨木镰刀菌F.sambucinum的引物，该引物可以成功检测到该菌，但也可扩增出燕麦镰刀菌F.avenaceum、黄色镰刀菌F.culmorum、禾谷镰刀菌F.graminearum和锐顶镰刀菌F.acuminatum等病原菌。2005年，Cullen等[5]通过实时荧光定量PCR和PCR酶联免疫吸附测定的方法对引起马铃薯干腐病的F.avenaceum、深蓝镰刀菌F.coeruleum、F.culmorum和硫色镰刀菌F.sulphureum进行了分子检测，通过ITS序列比对，利用其中具有差异的区域设计了针对F.coeruleum和F.sulphureum的特異性引物。而对于F.avenaceum和F.culmorum，由于ITS序列在这两个种间的差异不大，因此不能用该片段设计引物，为此，Cullen等分别利用Turner等[6]和Nicholson等[7]针对F.avenaceum和F.culmorum设计的引物进行试验，结果均成功地检测到相应的镰刀菌。2013年，李瑞琴等[8]通过ITS序列比对，设计了针对F.sambucinum和F.solani的特异性引物，并检测了这两种病原菌在连作马铃薯根际的动态变化。
事实上，虽然前人将ITS序列用于镰刀菌分类研究并取得了一定的结果，但关于ITS是否真正适用于镰刀菌的分类鉴定仍存在许多争议。YliMattila等[9]用通用引物扩增梨孢镰刀菌F.poae、F.langsethiae、拟枝孢镰刀菌F.sporotrichioides和九州镰刀菌F.kyushuense的ITS、IGS、βtubulin片段，UPPCR杂交的结果表明：ITS不能完全地区分这4个种，而βtubulin可用于种水平上的鉴定，IGS在亚种水平具有多样性。在这之后，Kvas等[10]对镰刀菌遗传演化多样性的研究进行了概述，认为一些镰刀菌，尤其是有性态属于赤霉属的镰刀菌，其ITS2区域存在非同源拷贝，致使其不能真实准确地用于镰刀菌分类，而28S rRNA、线粒体小亚基（mtSSU）、βtubulin、组蛋白3、钙调蛋白和翻译延伸因子（TEF1α）可以用来鉴定镰刀菌。其他研究也论证了TEF1α是在种的水平上信息量很高的单拷贝基因，利用TEF1α基因序列设计得到的引物非常适用于镰刀菌属种的鉴定[1112]。 本研究利用镰刀菌属TEF1α序列设计特异性引物，可为马铃薯干腐病菌的优势种群F.sambucinum的准确鉴定和快速检测提供技术和方法。对病害进行快速检测可及时淘汰病薯，对于减少因干腐病造成的损失具有重要意义。
1材料与方法
1.1供试菌株
本研究中供试菌株种名、寄主、来源相关信息见表1。
1.2菌丝基因组DNA的提取
取少量培养好的菌丝，采用CTAB法[13]提取DNA，加适量灭菌超纯水（含20 μg/mL RNase）溶解DNA，37℃处理1 h后，-20℃保存备用。
1.3马铃薯发病组织DNA的快速提取
马铃薯块茎发病组织DNA提取采用改进的玻璃珠振荡法[14]：用灭菌解剖刀切取接种接骨木镰刀菌后发病马铃薯块茎的病健交界处，放入1.5 mL离心管中，加入适量石英砂，再加入500～800 μL微量粗提取缓冲液TE，用台钻充分研磨，将离心管在漩涡仪上大于2 000 r/min振荡5 min。常温下，14 000 r/min离心10 min，吸取上清液直接用于PCR扩增，或将含有DNA的上清液保存于-20℃条件下备用。
1.4特异引物设计
从GenBank中下载镰刀菌属TEF1α基因的所有序列。用ClustalX 1.81[15]对下载序列进行比对，并用BioEdit 7.0.1[13]进行人工调整，通过DAMBE 4.2.13[16]保留一条碱基完全相同而名称不同的序列作为该单倍型的代表序列，最终所有保留的单倍型构成镰刀菌属TEF1α序列的数据组。对该数据组进行分析，找出各个种内保守而种间差异较大的变异区，设计接骨木镰刀菌的特异引物，并用GenBank中primerBLAST检测引物的特异性。引物由北京天一辉远生物科技有限公司合成。
1.5引物特异性检测
用特异性引物FsF/FsR对接骨木镰刀菌、其他镰刀菌以及马铃薯重要病害病原菌进行PCR扩增，以ddH2O为阴性对照。PCR反应体系为25 μL，其中，DNA模板1 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。扩增程序为：94℃ 4 min；94℃ 40 s，61℃ 40 s，72℃ 20 s，28个循环；72℃ 7 min；4℃保存。扩增完毕，取5 μL扩增产物于1%琼脂糖凝胶进行电泳检测。
1.6引物灵敏度检测
使用紫外分光光度计测量接骨木镰刀菌基因组DNA浓度，采用10倍梯度稀释法，将提取的基因组DNA从700 ng/μL逐级稀释为70 fg/μL 8个不同浓度梯度。应用特异性引物FsF/FsR，利用1.5中的PCR反应体系、反应程序，以稀释的各个浓度的DNA为模板进行扩增，确定该PCR体系能检测到接骨木镰刀菌的最低浓度。
1.7马铃薯发病组织的快速检测
马铃薯干腐病的人工接种参考Choiseul等[17]的伤口接种法。将大小一致的健康马铃薯薯块先后用自来水和无菌水清洗干净之后用75%乙醇表面消毒，自然晾干待用。用直径5 mm的打孔器在薯块上打取3 mm深的3个小孔，将在PDA平板上培养7 d、直径为5 mm的HW114菌饼接种于小孔中，再将原薯块组织轻轻塞回。共接种10个薯块，另接种无菌PDA培养基圆片为对照。接种薯块置于保湿装置内，25℃恒温培养。
用灭菌解剖刀切取接种接骨木镰刀菌后发病马铃薯块茎的病健交界处，提取DNA，以健康块茎及接种无菌水的块茎为对照，利用1.5建立的检测体系，对马铃薯干腐病发病组织进行检测。
2结果与分析
2.1接骨木镰刀菌特异引物的确定
从GenBank上共下载镰刀菌属TEF1α序列2 468条，对其进行比对、删除重复序列、人工调整，最终剩余632条。分析找出了接骨木镰刀菌种内保守而与其他镰刀菌种间差异较大的序列区域，设计了种专一性的引物对FsF/FsR（FsF：5′GACCCAAATCTAAGCTCGCC3′；FsR：5′GAAGGGCATGTCGCTCAAG3′）。该引物扩增片段长度为309 bp。用GenBank中primerBLAST检测引物的特异性，发现设计的引物序列仅能与GenBank中接骨木镰刀菌的TEF1α序列完全匹配，表明引物FsF/FsR是特异的。
2.2引物FsF/FsR特异性检测
利用特异性引物FsF/FsR对接骨木镰刀菌、本研究分离的另外3种干腐病菌、其他作物上的镰刀菌、马铃薯晚疫病菌、黑痣病菌及早疫病菌进行了PCR扩增。结果表明：该引物从接骨木镰刀菌中均可扩增出309 bp的特异性条带，而其他菌株和ddH2O对照均未扩增出任何条带（图1），表明该引物具有很高的特异性，能够用于接骨木镰刀菌的快速分子鉴定。
2.3引物FsF/FsR对接骨木镰刀菌分子检测的灵敏度
供试接骨木镰刀菌基因组DNA的浓度为700 ng/μL。通过10倍梯度稀释法稀释DNA，得到8个浓度梯度，即700 ng/μL、70 ng/μL、7 ng/μL、700 pg/μL、70 pg/μL、7 pg/μL、700 fg/μL和70 fg/μL。利用1.5中的PCR体系和程序检测特异引物扩增的灵敏度。结果表明，该PCR反应能检测的最低DNA濃度为70 pg/μL（图2）。
2.4发病薯块中病原菌的分子检测
人工接种接骨木镰刀菌后，对发病薯块进行PCR扩增。被侵染的薯块组织中可以检测到接骨木镰刀菌，在309 bp处出现特异性条带，而健康薯块和接种无菌水的薯块中均无该特异性条带（图3），证明该方法可以准确地检测出引起马铃薯干腐病的接骨木镰刀菌。 3讨论
TEF1α是在种水平上信息量很高的单拷贝基因，适用于镰刀菌种的鉴定[1112]。本研究基于镰刀菌TEF1α序列设计的接骨木镰刀菌的特异引物FsF/FsR，通过普通PCR对接骨木镰刀菌基因组DNA检测的最低浓度为70 pg/μL。这比陈恩发[18]利用普通PCR检测接骨木镰刀菌的灵敏度（196.35 pg/μL）高，但比实时荧光定量PCR的灵敏度（19.635 pg/μL）稍低。在引物设计时发现，与接骨木镰刀菌亲缘关系最近的是F.venenatum。
1995年，Nirenberg[19]报道了在马铃薯上分离得到了F.venenatum，本研究设计的引物恰好选取在这两种镰刀菌的差异区，并且F.venenatum主要危害大麦和小麦[20]，因此，近缘种F.venenatum对马铃薯上接骨木镰刀菌的检测无影响。
陈恩发[18]根据不同镰刀菌TEF1α序列设计了一对引物，该引物可检测出马铃薯干腐病主要致病菌，扩增片段为147～170 bp，但文中仅提供了接骨木镰刀菌的扩增片段为168 bp，而对供试的尖孢镰刀菌、锐顶镰刀菌、木贼镰刀菌和燕麦镰刀菌并未说明扩增片段，也未叙述上述4种镰刀菌的具体检测结果。此外，同一对引物对5个镰刀菌种类扩增仅存在23 bp的差异，无论是利用普通PCR还是实时定量PCR进行检测，均会因为片段差异过小而不能很好地分辨各个种类。同样，Atallah等[4]应用实时荧光定量PCR对5种干腐病菌进行了检测和定量，利用β微管蛋白基因设计了一对检测接骨木镰刀菌的引物，可以成功检测到该菌，但同时该引物也可扩增出其他4种镰刀菌。由于不同种类的镰刀菌的生物学特性和对药剂的敏感性不同，因此针对不同镰刀菌所制定的防治方案也不完全相同，不能准确区分每种镰刀菌，就不能为干腐病防治提供科学的理论依据。本研究建立的分子检测方法能特异地检测接骨木镰刀菌，而其他干腐病菌不能被检出。因此，本试验建立的分子检测技术可以经济、准确、快速地检测到接骨木镰刀菌，为病害的诊断及科学防治提供理论依据。
参考文献
[1]于俊琴. 马铃薯种薯贮藏期间干腐病的发生及防治措施[J]. 天津农林科技， 2002（4）： 9.
[2]Wharton P， Hammerschmidt R， Kirk W.Fusarium dry rot [M]. Michigan State University Extension， 2007.
[3]Rout M K， Mohapatra K B， Swain S K. Effect of environmental parameters on growth of three pathogenic fungi of groundnut [J]. Environment and Ecology， 2012， 30（3B）： 935937.
[4]Atallah Z K， Stevenson W R.A methodology to detect and quantify five pathogens causing potato tuber decay using realtime quantitative polymerase chain reaction [J]. Phytopathology， 2006， 96（9）： 10371045.
[5]Cullen D W， Toth I K， Pitkin Y， et al. Use of quantitative molecular diagnostic assays to investigate Fusarium dry rot in potato stocks and soil [J]. Phytopathology， 2005， 95（12）： 14621471.
[6]Turner A S， Lees A K， Rezanoor H N， et al. Refinement of PCRdetection of Fusarium avenaceum and evidence from DNA marker studies for phenetic relatedness to Fusarium tricinctum [J]. Plant Pathology，1998， 47（3）： 278288.
[7]Nicholson P， Simpson D R， Weston G， et al. Detection and quantification of Fusarium culmorum and Fusarium graminearum in cereals using PCR assays [J]. Physiological and Molecular Plant Pathology， 1998， 53（1）： 1737.
[8]李瑞琴，劉星，邱慧珍，等. 连作马铃薯根际干腐病优势病原菌荧光定量PCR快速检测及在根际的动态变化[J]. 草业科学， 2013， 22（6）： 239248.
[9]YliMattila T， Mach R， Alekhina I A， et al. Phylogenetic relationship of Fusarium langsethiae to Fusarium poae and Fusarium sporotrichioides as inferred by IGS， ITS， βtubulin sequences and UPPCR hybridization analysis [J]. International Journal of Food Microbiology， 2004， 95（3）：267285. [10]Kvas M， Marasas W F O， Wingfield B D， et al. Diversity and evolution of Fusarium species in the Gibberella fujikuroi complex [J]. Fungal Diversity， 2009， 34： 121.
[11]Knutsen A K， Torp M， HolstJensen A.Phylogenetic analyses of the Fusarium poae， Fusarium sporotrichioides and Fusarium langsethiae species complex based on partial sequences of the translation elongation factor1 alpha gene [J]. International Journal of Food Microbiology， 2004， 95（3）： 287295.
[12]Geiser D M， del Mar JimenezGasco M， Kang S， et al. FUSARIUMID v. 1.0： a DNA sequence database for identifying Fusarium [J].European Journal of Plant Pathology，2004，110（5）：473479.
[13]Pipe N D， Azcoitia V， Shaw D S.Selffertility in Phytophthora infestans： heterokaryons segregate several phenotypes [J]. Mycological Research， 2000， 104（6）： 676680.
[14]李海娟，孫银银，权军利，等. 快速粗提取致病疫霉菌菌丝DNA的方法[J]. 北方园艺， 2010（17）： 168170.
[15]Thompson J D， Gibson T J， Plewniak F， et al. The Clustal_X windows interface： flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools [J]. Nucleic Acids Research， 1997， 25（24）： 48764882.
[16]Xia X， Xie Z. DAMBE： software package for data analysis in molecular biology and evolution[J]. Journal of Heredity， 2001， 92（4）： 371373.
[17]Choiseul J， Allen L， Carnegie S F.Fungi causing dry tuber rots of seed potatoes in storage in Scotland [J]. Potato Research， 2007， 49（4）： 241253.
[18]陈恩发. 多重实时定量PCR检测马铃薯主要的真细菌病原菌[D]. 呼和浩特： 内蒙古大学， 2011.
[19]Nirenberg H I. Morphological differentiation of Fusarium sambucinum Fuckel sensu stricto， F.torulosum （Berk.