论文部分内容阅读
摘要：Argonaute（AGO）蛋白是小RNA分子诱导的沉默复合体（RISC）的核心因子，以玉米自交系B73为材料，利用RLM-RACE技术，克隆得到玉米17个AGO基因的全长cDNA序列，发现6个成员具有5′非翻译外显子，可能其表达受此机制调控。同时，利用半定量RT-PCR对其在玉米幼苗不同根系组织（包括初生胚根、冠根、次生胚根和侧根）进行表达分析，结果表明：未检测到ZmAGO5b、ZmAGO18b表达，ZmAGO1a/b、ZmAGO2a、ZmAGO10在各类根系中高水平表达，其他11个ZmAGOs表达水平较低，因此揭示选择性表达不同的ZmAGOs可能是不同类型的根系分化及其功能的精细调控所必需的。
关键词：Argonaute基因；克隆；5′非翻译外显子；表达
中图分类号： S513.01；Q785
文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2016）04-0041-04
在真核生物中，小RNA（small RNA：sRNA）介导转录水平、转录后水平以及染色质水平的基因沉默。植物内源 sRNA 包括microRNA （miRNA）和各类小干扰RNA（short interfering RNA，siRNA）[1]。在已知的由sRNA介导的基因表达调控途径中，sRNA必须与Argonaute（AGO）蛋白形成沉默复合体（RNA-induced silencing complex：RISC）引导sRNA通过序列互补与靶标（RNA或DNA）结合，进而降解mRNA、抑制翻译或修饰染色质[1]。由此可见，AGO蛋白是sRNA行使其功能的重要因子。Argonaute蛋白最初是在植物中发现的[2]，是一类分子量较大、含有可变的N端、PAZ、MID和PIWI结构域的蛋白质[3-4]，其中PAZ和PIWI属于保守结构域。在细菌和人类中的研究揭示了PAZ、MID、PIWI结构域在小RNA调控途径中的作用[5-6]。其中，MID结合小RNA的5′-磷酸端，使小RNA锚定在AGO蛋白上；PAZ识别小RNA突出的3′ 端[3-4]；PIWI会形成一种类似于RNase H酶的折叠结构，具有内源核酸酶的活性。有研究发现，PIWI内存在保守的活性位点Asp-Asp-His（DDH motif）[7]，但DDH motif存在与否并不能完全代表AGO蛋白是否具有催化功能[8]。在拟南芥中，证实有催化功能的AGO蛋白有AtAGO1、AtAGO4、AtAGO7 和AtAGO10[9-13]。
不同物种中，AGO蛋白的数目不同。拟南芥基因组中注释有10个AGO蛋白，水稻中有19个AGO蛋白，玉米中有17个AGO蛋白。拟南芥的AGO蛋白大致可分为三大类，AGO1、AGO5 和AGO10为第1类，AGO2、AGO3、AGO7为第2类，AGO4、AGO6、AGO8和AGO9为第3类[14]。Kapoor等把水稻和拟南芥AGO蛋白划分为四大类，分别为AGO1、MEL1/AGO5、ZIPPY/AGO7和AGO4[15]。Zhai等将玉米中的AGO蛋白划分为五大类，将与OsAGO18同源性较高的2个蛋白单独划为一类[16]。目前證实，植物中的AGO1主要参与miRNA通路，在植物的各个生长发育阶段均起着重要的调控作用[9，17]。在拟南芥中，与AtAGO1亲缘关系最近的AtAGO10突变后表现为茎尖分生组织发育异常，AtAGO1和AtAGO10竞争结合miR165/miR166，调节HD-ZIP Ⅲ 的表达，进而调节SAM发育和保持[18]。拟南芥中的AtAGO5仅在生殖组织中表达[19]，与水稻中的OsMEL1表达相似[15]。AGO7在反式作用的短干扰RNA（trans-acting short interfering RNAs，tasiRNA）的形成及其功能途径中起重要作用[12]。AtAGO2与AtAGO3结构高度相似且功能冗余，AGO2在植物逆境环境下高效表达[15]，暗示在抗逆过程中起重要作用。AGO4蛋白主要是围绕RNA介导的DNA甲基化（RdDM）过程中的作用机制展开，在整个发育过程中均有较高水平表达[15]。AGO6、AGO4在DNA甲基化上存在部分功能冗余，最近的研究证实AtAGO6在拟南芥茎和根的分生组织中存在RNA介导转录水平基因沉默的功能[20]。AtAGO8、AtAGO9序列相似度很高，其中，AtAGO8在拟南芥所有组织中表达量均较低，被认为是一个假基因[21]。最近的报道发现拟南芥中的 AtAGO9 在胚珠和花药中的表达量非常高[22]。而与AtAGO9高度同源的玉米AGO104基因，控制玉米的无融合生殖，在性母细胞旁的体细胞大量富集[23]。截至目前，植物不同根系中AGO基因家族的表达模式还未见报道。
玉米（Zea mays L.）是当今世界最重要的粮、饲、能源、工业原料兼用的高产作物。根系是玉米重要的组织器官，在保持植株形态、水分和营养吸收与运输、响应植物对环境胁迫等方面起着重要的作用。本研究以玉米测序自交系B73为材料，选取玉米幼苗不同根系组织包括初生胚根、冠根、次生胚根和侧根对17个AGO基因进行表达分析，为探索AGO基因在根系形态建成方面的调控机制奠定基础，与此同时，利用RACE技术对玉米17个AGO基因的全长cDNA进行克隆测序分析，以完善玉米AGO基因的序列信息，为全面解析玉米的AGO基因提供基础。
1 材料与方法
1.1 供试材料
本试验选用的材料玉米自交系B73，为美国优良自交系，配合力好，具有参考基因组序列。
选取大小均匀、籽粒饱满的玉米B73种子用15%的H2O2浸泡30 min进行表面消毒处理后，灭菌蒸馏水冲洗3次，播种于沙钵中（沙子高压灭菌），室内培养。当初生胚根和次生胚根长出时，分别取样，最后取侧根、冠根，每种根系取样不少于3株，液氮速冻，-80 ℃冰箱保存。
关键词：Argonaute基因；克隆；5′非翻译外显子；表达
中图分类号： S513.01；Q785
文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2016）04-0041-04
在真核生物中，小RNA（small RNA：sRNA）介导转录水平、转录后水平以及染色质水平的基因沉默。植物内源 sRNA 包括microRNA （miRNA）和各类小干扰RNA（short interfering RNA，siRNA）[1]。在已知的由sRNA介导的基因表达调控途径中，sRNA必须与Argonaute（AGO）蛋白形成沉默复合体（RNA-induced silencing complex：RISC）引导sRNA通过序列互补与靶标（RNA或DNA）结合，进而降解mRNA、抑制翻译或修饰染色质[1]。由此可见，AGO蛋白是sRNA行使其功能的重要因子。Argonaute蛋白最初是在植物中发现的[2]，是一类分子量较大、含有可变的N端、PAZ、MID和PIWI结构域的蛋白质[3-4]，其中PAZ和PIWI属于保守结构域。在细菌和人类中的研究揭示了PAZ、MID、PIWI结构域在小RNA调控途径中的作用[5-6]。其中，MID结合小RNA的5′-磷酸端，使小RNA锚定在AGO蛋白上；PAZ识别小RNA突出的3′ 端[3-4]；PIWI会形成一种类似于RNase H酶的折叠结构，具有内源核酸酶的活性。有研究发现，PIWI内存在保守的活性位点Asp-Asp-His（DDH motif）[7]，但DDH motif存在与否并不能完全代表AGO蛋白是否具有催化功能[8]。在拟南芥中，证实有催化功能的AGO蛋白有AtAGO1、AtAGO4、AtAGO7 和AtAGO10[9-13]。
不同物种中，AGO蛋白的数目不同。拟南芥基因组中注释有10个AGO蛋白，水稻中有19个AGO蛋白，玉米中有17个AGO蛋白。拟南芥的AGO蛋白大致可分为三大类，AGO1、AGO5 和AGO10为第1类，AGO2、AGO3、AGO7为第2类，AGO4、AGO6、AGO8和AGO9为第3类[14]。Kapoor等把水稻和拟南芥AGO蛋白划分为四大类，分别为AGO1、MEL1/AGO5、ZIPPY/AGO7和AGO4[15]。Zhai等将玉米中的AGO蛋白划分为五大类，将与OsAGO18同源性较高的2个蛋白单独划为一类[16]。目前證实，植物中的AGO1主要参与miRNA通路，在植物的各个生长发育阶段均起着重要的调控作用[9，17]。在拟南芥中，与AtAGO1亲缘关系最近的AtAGO10突变后表现为茎尖分生组织发育异常，AtAGO1和AtAGO10竞争结合miR165/miR166，调节HD-ZIP Ⅲ 的表达，进而调节SAM发育和保持[18]。拟南芥中的AtAGO5仅在生殖组织中表达[19]，与水稻中的OsMEL1表达相似[15]。AGO7在反式作用的短干扰RNA（trans-acting short interfering RNAs，tasiRNA）的形成及其功能途径中起重要作用[12]。AtAGO2与AtAGO3结构高度相似且功能冗余，AGO2在植物逆境环境下高效表达[15]，暗示在抗逆过程中起重要作用。AGO4蛋白主要是围绕RNA介导的DNA甲基化（RdDM）过程中的作用机制展开，在整个发育过程中均有较高水平表达[15]。AGO6、AGO4在DNA甲基化上存在部分功能冗余，最近的研究证实AtAGO6在拟南芥茎和根的分生组织中存在RNA介导转录水平基因沉默的功能[20]。AtAGO8、AtAGO9序列相似度很高，其中，AtAGO8在拟南芥所有组织中表达量均较低，被认为是一个假基因[21]。最近的报道发现拟南芥中的 AtAGO9 在胚珠和花药中的表达量非常高[22]。而与AtAGO9高度同源的玉米AGO104基因，控制玉米的无融合生殖，在性母细胞旁的体细胞大量富集[23]。截至目前，植物不同根系中AGO基因家族的表达模式还未见报道。
玉米（Zea mays L.）是当今世界最重要的粮、饲、能源、工业原料兼用的高产作物。根系是玉米重要的组织器官，在保持植株形态、水分和营养吸收与运输、响应植物对环境胁迫等方面起着重要的作用。本研究以玉米测序自交系B73为材料，选取玉米幼苗不同根系组织包括初生胚根、冠根、次生胚根和侧根对17个AGO基因进行表达分析，为探索AGO基因在根系形态建成方面的调控机制奠定基础，与此同时，利用RACE技术对玉米17个AGO基因的全长cDNA进行克隆测序分析，以完善玉米AGO基因的序列信息，为全面解析玉米的AGO基因提供基础。
1 材料与方法
1.1 供试材料
本试验选用的材料玉米自交系B73，为美国优良自交系，配合力好，具有参考基因组序列。
选取大小均匀、籽粒饱满的玉米B73种子用15%的H2O2浸泡30 min进行表面消毒处理后，灭菌蒸馏水冲洗3次，播种于沙钵中（沙子高压灭菌），室内培养。当初生胚根和次生胚根长出时，分别取样，最后取侧根、冠根，每种根系取样不少于3株，液氮速冻，-80 ℃冰箱保存。