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摘要
[目的]测定15种中草药提取物抗TMV的活性。[方法]利用半叶枯斑法，初筛测定15种中草药对TMV钝化作用，复筛测定其对TMV初侵染和复制增殖作用。[结果]商陆、大黄、板蓝根、金银花4种中草药表现出明显的TMV体外钝化作用，其钝化抑制率均在50%以上；复筛测定4种中草药抗TMV初侵染和复制增殖活性，大黄表现出较好的活性，且与其他3种中草药相比差异显著。盆栽试验表明，植物提取液（大黄）在100倍液下，喷雾加灌根的施药方式对烟草病毒病的防效最好，达49.00%，优于对照药剂20%吗啉胍·乙铜可湿性粉剂。[结论]15种中草药中大黄具有较优的抗TMV活性，值得进一步研究。
关键词中草药；烟草花叶病毒；心叶烟；曼陀罗
中图分类号S567文献标识码A文章编号0517-6611（2014）06-01691-03
Abstract[Objective] The aim was to study the active determination of the extracts of 15 kinds of Chinese traditional medicine against TMV. [Method] Using half leaf blight spot method， 15 kinds of Chinese traditional medicine against TMV in vitro was determined in the experiment of initial screening， after screened again through the experiments of inhibiting TMV infection and inhibiting the multiplication of TMV. [Result] Four kinds of Chinese herbal medicine， Phytolacca acinosa Roxb.， Rheum palmatum L.， Isatis tinctoria， Lonicera japonica Thunb.， had an obvious inactivation on TMV in vitro， and the inhibition rate was more than 50%. After screened again through the experiments of inhibiting TMV infection and inhibiting the multiplication of TMV， Rheum palmatum L. showed better activity. It had a significant difference compared with the other three kinds of Chinese traditional medicine. In the field plot trials， the extract of Rheum palmatum L.（100 times， spraying+pouring ）was better than Moroxydine+Cupric acetate， W.P.（20%） and had the best inhibition rate（49.00%）. [Conclusion] Rheum palmatum L. had the best activity against TMV， and was worth further studying.
Key words Chinese traditional medicine； TMV； Nicotiana glutinosa L.； Datura stramonium L.
植物病毒病的防治相对于病（真菌、细菌）、虫、草等的防治较为困难，全世界每年因其造成的经济损失高达数百亿元，然而成为商品的抗植物病毒剂较少[1-5]。面对植物病毒病发生日益严重，抗植物病毒药剂依然匮乏的局面，继续深入开展抗植物病毒剂的研究具有十分重要的意义。
我国作为植物源农药研究和使用最早的国家，其抗病毒问题的研究主要是伴随着中医和中草药的发展而出现的。很多具有较好抗病毒（动物）活性的中草药对于抗植物病毒活性的研究值得借鉴。基于此，笔者以烟草花叶病毒（TMV）为研究对象，将15种常见的抗病毒中草药的抗TMV活性进行比较研究[6-8]。另外，为保证活性测定的准确性，选择心叶烟和曼陀罗2种枯斑寄主作为活性指示材料，在对15种中草药抗TMV体外钝化试验后，选择具有较优抗病毒活性的中草药进行复筛，并测定其在普通煙上的抗TMV活性，以期为我国植物源农药的研究与开发积累资料。
1 材料与方法
1.1 枯斑寄主
心叶烟（Nicotiana glutinosa L.）、曼陀罗（Datura stramonium L.）。将心叶烟或曼陀罗种子与一定量基质混匀后均匀洒在装有基质的育苗盘中，浇水适量，置于适宜条件下（温度22 ℃，光照16 h/d，湿度60%）培养，当幼苗长至4～6片真叶时供试[9]。
1.2供试植物
15种中草药全部购自黑龙江省医药公司，经相关专家鉴定确认后，50 ℃烘干后，粉碎，过40目筛，室温保存备用。
1.3供试毒源
烟草花叶病毒（Tobacco Mosaic Virus， TMV）由西北农林科技大学农业部植物病理研究所提供。参照王人元[10]的方法对其提纯，提纯后的病毒经紫外扫描呈典型的TMV核蛋白吸收曲（A260/A280=1.20），病毒接种液用PBS缓冲液定容为20 μg/ml。 1.4植物提取物的制备
称取各植物材料50 g，5倍量95%乙醇回流提取3次，每次30 min，合并3次提取液，过滤，减压浓缩至膏状，称重后用少量二甲亚砜（DMSO）溶解后配成10 mg/ml的水溶液，置于4 ℃冰箱备用。
1.5试验方法
1.5.1
对TMV体外钝化作用测定。采用半叶枯斑法[11]测定。选取生长旺盛的4～6叶期心叶烟或曼陀罗，左半叶接种供试药剂与病毒等体积混合液（用植物提取液50倍液钝化病毒），右半叶接种蒸馏水与病毒等体积混合液（对照）。试验重复3次，5～7 d后计算枯斑数，枯斑抑制率按照“1.7”中公式计算。
1.5.2
对TMV初侵染和复制增殖作用测定。
采用半叶枯斑法[11]测定。选取生长旺盛的4～6叶期心叶烟或曼陀罗，初侵染试验中先在供试植物左半叶施药，间隔5 min后，再全叶接种病毒；复制增殖试验中先全叶接种病毒，间隔5 min后，再在供试植物左半叶施药。中草药提取液供试浓度为50倍水稀释液，吗啉胍·乙铜施药浓度为400倍液，病毒接种浓度为10 mg/L。试验重复3次，5～7 d后计算枯斑数，按“1.7”中公式计算枯斑抑制率。
1.6盆栽试验
试验设大黄提取液100倍液和200倍液2个剂量，喷雾、灌根、喷雾加灌根3种处理方法，以20%的吗啉胍·乙铜可湿性粉剂400倍液常量喷雾为对照，并设清水对照，共计8个处理，每个处理重复3次，每个重复10株烟苗；自发病初期开始施药，每隔7 d施药1次，共3次。3次施药7 d后调查病情，统计防效。病情分级标准：0级：全株无病；1级：心叶脉明或轻微花叶，植株无明显矮化；3级：1/3叶片花叶但不变形，或植株矮化为正常株高的3/4；5级：1/3～1/2叶片花叶，或少数叶片变形，或主脉变黑，或植株矮化为正常株高的2/3～3/4；7级：1/2～2/3叶片花叶、变形或主侧脉坏死，或植株矮化为正常株高的1/2～2/3以上；9级：全株叶片花叶、严重变形或坏死，或植株矮化为正常株高的1/2以上[12]。
3 小结与讨论
（1）该研究对15种中草药样品进行了抗TMV活性研究。在对TMV体外钝化作用方面，商陆、大黄、板蓝根、金银花4种中草药表现出较好的活性，在抗TMV初侵染和复制增殖方面，大黄表现出较好的活性。盆栽试验中植物提取液（大黃）在100倍液下，喷雾加灌根的施药方式对烟草病毒病的防效最好，达49.00%，优于对照药剂20%吗啉胍·乙铜可湿性粉剂。
（2）该研究采用心叶烟和曼陀罗2种指示植物作为枯斑寄主，主要是考虑到接种病毒的不确定因素很多，接种时每次摩擦的轻重、接种后到对接种叶片进行水洗之前的时间、水洗时间等方面都影响到病斑数的多少；同时由于心叶烟和曼陀罗本身对TMV的抗性也不相同，采用2种枯斑寄主会大大增加试验结果的可靠性。
（3）室内盆栽试验表明，植物提取液（大黄）以喷雾加灌根施药效果最好，由此初步推测植物提取液（大黄）可能具有一定的内吸作用。这可能与植物提取液（大黄）中含有大量的小分子抗病毒物质有关，而小分子物质来源于植物，易被植物吸收。关于植物提取液（其他类中草药）是否普遍都具有内吸作用还有待于进一步深入研究。
（4）该研究以烟草花叶病毒作为基本防治对象，实际大田作物发病时往往是多种病毒的混合感染，所以用烟草花叶病毒筛选出的抗病毒中草药是否对其他病毒也具有较好的防效还值得进一步研究。
参考文献
[1]
陈齐斌， 沈嘉祥. 抗植物病毒剂研究进展和面临的挑战与机遇[J].云南农业大学学报，2005，20（4）：505-511.
[2] SLUSARENKO A J，FRASER R S，VAN LOON L C.Mechanisms of Resistance to Plant Disease[M].Netherlands：Kluwer Academic Publishes，2000：480.
[3] CULVER J N，PADMANABBAN M S.Virusinduced disease：Altering host physiology one interaction at a time[J].Annual Review of Phytopathology，2007，4：221-243.
[4] 江山，韩熹莱.植物病毒病化学防治的研究进展[J].中国病毒学，1995，10（1）：1-7.
[5] 邱并生，王敏.植物病毒学的研究进展[J].中国病毒学，2004，19（3）：309-312.
[6] 苏水方，裘维蕃.几种中草药的抽提物对黄瓜花叶病毒引起的辣椒花叶病治疗作用初步研究[J].植物病理学报，1989，19（2）：123-128.
[7] 侯玉霞，李重九，马立新，等.中草药中抗植物病毒TMV活性物质PZI作用机理研究[J].中国农业大学学报，2000，5（1）：21-24.
[8] 安天英，杨诏，李在国，等.牛心朴子草中抗烟草花叶病毒活性成分的分离与鉴定[M]//张兴.植物农药与药剂毒理学研究进展.北京：中国农业科学出版社，2002：212-217.
[9] 李晨.植物源抗病毒剂VFB的配方及加工工艺优化[D].杨凌：西北农林科技大学，2012.
[10] 王人元.PEG蔗糖正反浓度梯度离心法提纯植物病毒的研究[J].东北农业大学学报，1990，21（3）：298-302.
[11] 田波，裴美云.植物病毒研究方法：上册[M].北京：科学出版社，1987.
[12] 全国烟草总公司青州烟草研究所.中华人民共和国国家标准：GB/T 23222-2008烟草病虫害分级及调查方法[S].北京：中国标准出版社，2008.
[目的]测定15种中草药提取物抗TMV的活性。[方法]利用半叶枯斑法，初筛测定15种中草药对TMV钝化作用，复筛测定其对TMV初侵染和复制增殖作用。[结果]商陆、大黄、板蓝根、金银花4种中草药表现出明显的TMV体外钝化作用，其钝化抑制率均在50%以上；复筛测定4种中草药抗TMV初侵染和复制增殖活性，大黄表现出较好的活性，且与其他3种中草药相比差异显著。盆栽试验表明，植物提取液（大黄）在100倍液下，喷雾加灌根的施药方式对烟草病毒病的防效最好，达49.00%，优于对照药剂20%吗啉胍·乙铜可湿性粉剂。[结论]15种中草药中大黄具有较优的抗TMV活性，值得进一步研究。
关键词中草药；烟草花叶病毒；心叶烟；曼陀罗
中图分类号S567文献标识码A文章编号0517-6611（2014）06-01691-03
Abstract[Objective] The aim was to study the active determination of the extracts of 15 kinds of Chinese traditional medicine against TMV. [Method] Using half leaf blight spot method， 15 kinds of Chinese traditional medicine against TMV in vitro was determined in the experiment of initial screening， after screened again through the experiments of inhibiting TMV infection and inhibiting the multiplication of TMV. [Result] Four kinds of Chinese herbal medicine， Phytolacca acinosa Roxb.， Rheum palmatum L.， Isatis tinctoria， Lonicera japonica Thunb.， had an obvious inactivation on TMV in vitro， and the inhibition rate was more than 50%. After screened again through the experiments of inhibiting TMV infection and inhibiting the multiplication of TMV， Rheum palmatum L. showed better activity. It had a significant difference compared with the other three kinds of Chinese traditional medicine. In the field plot trials， the extract of Rheum palmatum L.（100 times， spraying+pouring ）was better than Moroxydine+Cupric acetate， W.P.（20%） and had the best inhibition rate（49.00%）. [Conclusion] Rheum palmatum L. had the best activity against TMV， and was worth further studying.
Key words Chinese traditional medicine； TMV； Nicotiana glutinosa L.； Datura stramonium L.
植物病毒病的防治相对于病（真菌、细菌）、虫、草等的防治较为困难，全世界每年因其造成的经济损失高达数百亿元，然而成为商品的抗植物病毒剂较少[1-5]。面对植物病毒病发生日益严重，抗植物病毒药剂依然匮乏的局面，继续深入开展抗植物病毒剂的研究具有十分重要的意义。
我国作为植物源农药研究和使用最早的国家，其抗病毒问题的研究主要是伴随着中医和中草药的发展而出现的。很多具有较好抗病毒（动物）活性的中草药对于抗植物病毒活性的研究值得借鉴。基于此，笔者以烟草花叶病毒（TMV）为研究对象，将15种常见的抗病毒中草药的抗TMV活性进行比较研究[6-8]。另外，为保证活性测定的准确性，选择心叶烟和曼陀罗2种枯斑寄主作为活性指示材料，在对15种中草药抗TMV体外钝化试验后，选择具有较优抗病毒活性的中草药进行复筛，并测定其在普通煙上的抗TMV活性，以期为我国植物源农药的研究与开发积累资料。
1 材料与方法
1.1 枯斑寄主
心叶烟（Nicotiana glutinosa L.）、曼陀罗（Datura stramonium L.）。将心叶烟或曼陀罗种子与一定量基质混匀后均匀洒在装有基质的育苗盘中，浇水适量，置于适宜条件下（温度22 ℃，光照16 h/d，湿度60%）培养，当幼苗长至4～6片真叶时供试[9]。
1.2供试植物
15种中草药全部购自黑龙江省医药公司，经相关专家鉴定确认后，50 ℃烘干后，粉碎，过40目筛，室温保存备用。
1.3供试毒源
烟草花叶病毒（Tobacco Mosaic Virus， TMV）由西北农林科技大学农业部植物病理研究所提供。参照王人元[10]的方法对其提纯，提纯后的病毒经紫外扫描呈典型的TMV核蛋白吸收曲（A260/A280=1.20），病毒接种液用PBS缓冲液定容为20 μg/ml。 1.4植物提取物的制备
称取各植物材料50 g，5倍量95%乙醇回流提取3次，每次30 min，合并3次提取液，过滤，减压浓缩至膏状，称重后用少量二甲亚砜（DMSO）溶解后配成10 mg/ml的水溶液，置于4 ℃冰箱备用。
1.5试验方法
1.5.1
对TMV体外钝化作用测定。采用半叶枯斑法[11]测定。选取生长旺盛的4～6叶期心叶烟或曼陀罗，左半叶接种供试药剂与病毒等体积混合液（用植物提取液50倍液钝化病毒），右半叶接种蒸馏水与病毒等体积混合液（对照）。试验重复3次，5～7 d后计算枯斑数，枯斑抑制率按照“1.7”中公式计算。
1.5.2
对TMV初侵染和复制增殖作用测定。
采用半叶枯斑法[11]测定。选取生长旺盛的4～6叶期心叶烟或曼陀罗，初侵染试验中先在供试植物左半叶施药，间隔5 min后，再全叶接种病毒；复制增殖试验中先全叶接种病毒，间隔5 min后，再在供试植物左半叶施药。中草药提取液供试浓度为50倍水稀释液，吗啉胍·乙铜施药浓度为400倍液，病毒接种浓度为10 mg/L。试验重复3次，5～7 d后计算枯斑数，按“1.7”中公式计算枯斑抑制率。
1.6盆栽试验
试验设大黄提取液100倍液和200倍液2个剂量，喷雾、灌根、喷雾加灌根3种处理方法，以20%的吗啉胍·乙铜可湿性粉剂400倍液常量喷雾为对照，并设清水对照，共计8个处理，每个处理重复3次，每个重复10株烟苗；自发病初期开始施药，每隔7 d施药1次，共3次。3次施药7 d后调查病情，统计防效。病情分级标准：0级：全株无病；1级：心叶脉明或轻微花叶，植株无明显矮化；3级：1/3叶片花叶但不变形，或植株矮化为正常株高的3/4；5级：1/3～1/2叶片花叶，或少数叶片变形，或主脉变黑，或植株矮化为正常株高的2/3～3/4；7级：1/2～2/3叶片花叶、变形或主侧脉坏死，或植株矮化为正常株高的1/2～2/3以上；9级：全株叶片花叶、严重变形或坏死，或植株矮化为正常株高的1/2以上[12]。
3 小结与讨论
（1）该研究对15种中草药样品进行了抗TMV活性研究。在对TMV体外钝化作用方面，商陆、大黄、板蓝根、金银花4种中草药表现出较好的活性，在抗TMV初侵染和复制增殖方面，大黄表现出较好的活性。盆栽试验中植物提取液（大黃）在100倍液下，喷雾加灌根的施药方式对烟草病毒病的防效最好，达49.00%，优于对照药剂20%吗啉胍·乙铜可湿性粉剂。
（2）该研究采用心叶烟和曼陀罗2种指示植物作为枯斑寄主，主要是考虑到接种病毒的不确定因素很多，接种时每次摩擦的轻重、接种后到对接种叶片进行水洗之前的时间、水洗时间等方面都影响到病斑数的多少；同时由于心叶烟和曼陀罗本身对TMV的抗性也不相同，采用2种枯斑寄主会大大增加试验结果的可靠性。
（3）室内盆栽试验表明，植物提取液（大黄）以喷雾加灌根施药效果最好，由此初步推测植物提取液（大黄）可能具有一定的内吸作用。这可能与植物提取液（大黄）中含有大量的小分子抗病毒物质有关，而小分子物质来源于植物，易被植物吸收。关于植物提取液（其他类中草药）是否普遍都具有内吸作用还有待于进一步深入研究。
（4）该研究以烟草花叶病毒作为基本防治对象，实际大田作物发病时往往是多种病毒的混合感染，所以用烟草花叶病毒筛选出的抗病毒中草药是否对其他病毒也具有较好的防效还值得进一步研究。
参考文献
[1]
陈齐斌， 沈嘉祥. 抗植物病毒剂研究进展和面临的挑战与机遇[J].云南农业大学学报，2005，20（4）：505-511.
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[4] 江山，韩熹莱.植物病毒病化学防治的研究进展[J].中国病毒学，1995，10（1）：1-7.
[5] 邱并生，王敏.植物病毒学的研究进展[J].中国病毒学，2004，19（3）：309-312.
[6] 苏水方，裘维蕃.几种中草药的抽提物对黄瓜花叶病毒引起的辣椒花叶病治疗作用初步研究[J].植物病理学报，1989，19（2）：123-128.
[7] 侯玉霞，李重九，马立新，等.中草药中抗植物病毒TMV活性物质PZI作用机理研究[J].中国农业大学学报，2000，5（1）：21-24.
[8] 安天英，杨诏，李在国，等.牛心朴子草中抗烟草花叶病毒活性成分的分离与鉴定[M]//张兴.植物农药与药剂毒理学研究进展.北京：中国农业科学出版社，2002：212-217.
[9] 李晨.植物源抗病毒剂VFB的配方及加工工艺优化[D].杨凌：西北农林科技大学，2012.
[10] 王人元.PEG蔗糖正反浓度梯度离心法提纯植物病毒的研究[J].东北农业大学学报，1990，21（3）：298-302.
[11] 田波，裴美云.植物病毒研究方法：上册[M].北京：科学出版社，1987.
[12] 全国烟草总公司青州烟草研究所.中华人民共和国国家标准：GB/T 23222-2008烟草病虫害分级及调查方法[S].北京：中国标准出版社，2008.