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摘 要：目的：采用HPLC法测定硫酸黏菌素组分含量。方法：测定色谱条件为：色谱柱为C18，5μm，4.6mm× 250mm，流动相为：称取无水硫酸钠13.38g用纯化水稀释至2700mL，用稀磷酸调节pH至2.3～2.5，加水稀释至3000mL，再加乙腈846mL，摇匀，过滤，即得。检测波长为215nm。结论：硫酸黏菌素在0.2～0.6mg/mL范围内线性关系良好，多黏菌素E1：相关系数R=0.9995、多黏菌素E2：相关系数R=0.9998、多黏菌素E3：相关系数R=0.9999、多黏菌素EI-1：相关系数R=0.9992、多黏菌素EI-7MOA：相关系数R=0.9996；硫酸黏菌素的回收率为98.6%～101.6%；多黏菌素E1重复性RSD为0.2%、多黏菌素E2重复性RSD为0.2%、多黏菌素E3重复性RSD为0.8%、多黏菌素EI-1重复性RSD为0.6%、多黏菌素EI-7MOA重复性RSD为0.5%。结论：该方法线性范围宽、分析时间短、样品前处理简便、定量结果准确、重现性好，为其质量控制提供了依据。
关键词：硫酸黏菌素；HPLC；组分含量测定
中图分类号 R521 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2017）12-0024-03
Abstract：Objective：To determine the colistin sulfate content by using the HPLC method.Methods：Determination of chromatographic condition：chromatographic column for C18，5μm，4.6mm×250mm，mobile phase：to get anhydrous sodium sulfate 13.38g diluted with purified water to 2700mL，adjusted the pH to 2.3～2.5 with dilute phosphoric acid，diluted with water to 3000mL，and then add acetonitrile 846mL，shake，filtering，is obtained.The detection wavelength was 215nm. Conclusion：colistin sulfate in 0.2～0.6mg/mL is in good linear relationship，and polymyxin E1：correlation coefficient R = 0.9995，polymyxin E2，correlation coefficient R=0.9998，polymyxin E3，correlation coefficient R=0.9999，polymyxin EI-1：the coefficient of R=0.9992，polymyxin EI-7MOA：correlation coefficient R=0.9996；colistin sulfate recovery rate is 98.6%～101.6%；polymyxin E1 RSD of repeatability was 0.2%，polymyxin E2 RSD of repeatability was 0.2%，polymyxin E3 RSD of repeatability was 0.8%，polymyxin E I-1 RSD of repeatability was 0.6%，polymyxin EI-7MOA repetitive RSD 0.5%.conclusion：it provides a basis for its quality control as its wide linear range，short analysis time，sample pretreatment is simple，accurate and reproducible.
Key words：Colistin sulfate；HPLC；Content determination
硫酸黏菌素又名克利斯汀、多粘菌素E、抗敵素等，系由多黏杆菌培养液中获得的碱性锁环状多肽类抗生素，是多黏菌素E1和E2的混合物。该产品为白色粉末，具有易溶于水、耐热、消化道不易吸收、排泄迅速、毒性小、无毒副作用、不易产生耐药菌株等特性。其对革兰氏阴性菌有很强的抗菌作用，几乎对所有革兰氏阴性菌有效，对绿脓杆菌有显著作用。
在鸡、猪的集约化饲养中，由大肠杆菌或沙门氏杆菌引起的动物疾病是一种常见病，感染面广、危害大。为了减少致病菌抗性的产生，世界范围内对抗生素的使用均有严格规定，人畜共用同种抗生素的现象日趋减少，硫酸黏菌素作为专用的兽用抗生素，能有效地防止这些致病菌的生长并提高饲料的转化率，同时还具有高效、低毒，在动物体内残留少的特点，在发达国家已广泛使用，产品供不应求。随着国内对该产品优越性的认识，需求量也在不断提高，国内市场显现出较大潜力。
本研究按照欧洲药典8.0要求[1]，根据硫酸黏菌素的结构特点，建立了测定硫酸黏菌素组分含量的HPLC法。该方法具有线性范围宽、分析时间短、样品前处理简便、定量结果准确、重现性好等特点，为硫酸黏菌素的质量控制提供可靠的依据。
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器 日本岛津SPD-20A液相色谱仪；柱温箱CTO-20AC；超纯水仪UPR-5T；超声波清洗器KQ-500DE；天平METTLER MS105DU；硫酸黏菌素标准品来源：Council of Europe；水为超纯水，乙腈为色谱纯。
1.2 色谱条件 流动相：称取无水硫酸钠13.38g用纯化水稀释至2700mL，用稀磷酸调节pH至2.3～2.5，加水稀释至3000mL，再加乙腈846mL，摇匀，过滤，即得。色谱柱：菲罗门 C18 5u 4.6×250mm，检测波长：215nm，流速：1.0mL/min，柱温：30℃，进样量：20μL。 1.3 对照品溶液的配制 稀释液：20%乙腈水。对照储备液：精密称取对照品230mg（实际称量重量：230.51mg，对照品含量87.2%），以稀释液溶解并稀释至50mL，制成约4mg/mL的对照储备液。取上述对照储备液10.0mL到100mL容量瓶中，加稀释液定容，制成约0.4mg/mL的对照液。
1.4 樣品溶液的配制 精密称取50mg试样到100mL容量瓶中，加稀释液适量溶解，定容，过滤即得。
1.5 系统适用性试验 取上述0.4mg/mL的对照溶液20μL分别按本次试验色谱条件下进样，测定并计算柱效、分离度和拖尾因子（具体数据见表1）。
1.6 线性实验 取上述照品储备溶液分别稀释成0.2mg/mL、0.32mg/mL、0.4mg/mL、0.48mg/mL、0.6mg/mL的系列对照品溶液，按1.2色谱条件测定，以峰面积对浓度进行回归，多黏菌素E1：Y=3E-07X（R=0.9995）、多黏菌素E2：Y=4E-07X（R=0.9998）、多黏菌素E3：Y=3E-06X（R=0.9999）、多黏菌素EI-1：Y=3E-05X（R=0.9992）、多黏菌素EI-7MOA：Y=2E-05X（R=0.9996）说明硫酸黏菌素在0.2～0.6mg/mL范围内具有良好的线性关系（具体见图1～图5）。
1.7 重复性试验 精密吸取同一供试品溶液，按1.2项色谱条件测定，进样6次，得多黏菌素E1面积的RSD为0.2%、多黏菌素E2面积RSD为0.2%、多黏菌素E3面积RSD为0.8%、多黏菌素EI-1面积RSD为0.6%、多黏菌素EI-7MOA面积RSD为0.5%，表明样品重复性良好。具体见表2。
1.8 回收率试验 精密取已知含量的同一批样品（约25mg（共9份）置于100mL容量瓶中，分别加入上述1.3.2项下对照储备液3mL、5mL、7mL，按上述1.4项要求处理，进样测定，样品硫酸黏菌素的回收率为100.0%，具体见表3。
2 结论
本实验建立了HPLC法测定硫酸黏菌素组分含量的方法，测定色谱条件为：色谱柱为菲罗门C18 5u4.6*250mm，流动相为称取无水硫酸钠13.38g用纯化水稀释至2700mL，用稀磷酸调节pH至2.3～2.5，加水稀释至3000mL，再加乙腈846mL，摇匀，过滤，即得。流速为1.0mL/min，检测波长为215nm，在0.2～0.6mg/mL范围内线性关系良好。该方法具有线性范围宽、分析时间短、样品前处理简便、定量结果准确、重现性好等特点，为其质量控制提供了依据。
（责编：张宏民）
关键词：硫酸黏菌素；HPLC；组分含量测定
中图分类号 R521 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2017）12-0024-03
Abstract：Objective：To determine the colistin sulfate content by using the HPLC method.Methods：Determination of chromatographic condition：chromatographic column for C18，5μm，4.6mm×250mm，mobile phase：to get anhydrous sodium sulfate 13.38g diluted with purified water to 2700mL，adjusted the pH to 2.3～2.5 with dilute phosphoric acid，diluted with water to 3000mL，and then add acetonitrile 846mL，shake，filtering，is obtained.The detection wavelength was 215nm. Conclusion：colistin sulfate in 0.2～0.6mg/mL is in good linear relationship，and polymyxin E1：correlation coefficient R = 0.9995，polymyxin E2，correlation coefficient R=0.9998，polymyxin E3，correlation coefficient R=0.9999，polymyxin EI-1：the coefficient of R=0.9992，polymyxin EI-7MOA：correlation coefficient R=0.9996；colistin sulfate recovery rate is 98.6%～101.6%；polymyxin E1 RSD of repeatability was 0.2%，polymyxin E2 RSD of repeatability was 0.2%，polymyxin E3 RSD of repeatability was 0.8%，polymyxin E I-1 RSD of repeatability was 0.6%，polymyxin EI-7MOA repetitive RSD 0.5%.conclusion：it provides a basis for its quality control as its wide linear range，short analysis time，sample pretreatment is simple，accurate and reproducible.
Key words：Colistin sulfate；HPLC；Content determination
硫酸黏菌素又名克利斯汀、多粘菌素E、抗敵素等，系由多黏杆菌培养液中获得的碱性锁环状多肽类抗生素，是多黏菌素E1和E2的混合物。该产品为白色粉末，具有易溶于水、耐热、消化道不易吸收、排泄迅速、毒性小、无毒副作用、不易产生耐药菌株等特性。其对革兰氏阴性菌有很强的抗菌作用，几乎对所有革兰氏阴性菌有效，对绿脓杆菌有显著作用。
在鸡、猪的集约化饲养中，由大肠杆菌或沙门氏杆菌引起的动物疾病是一种常见病，感染面广、危害大。为了减少致病菌抗性的产生，世界范围内对抗生素的使用均有严格规定，人畜共用同种抗生素的现象日趋减少，硫酸黏菌素作为专用的兽用抗生素，能有效地防止这些致病菌的生长并提高饲料的转化率，同时还具有高效、低毒，在动物体内残留少的特点，在发达国家已广泛使用，产品供不应求。随着国内对该产品优越性的认识，需求量也在不断提高，国内市场显现出较大潜力。
本研究按照欧洲药典8.0要求[1]，根据硫酸黏菌素的结构特点，建立了测定硫酸黏菌素组分含量的HPLC法。该方法具有线性范围宽、分析时间短、样品前处理简便、定量结果准确、重现性好等特点，为硫酸黏菌素的质量控制提供可靠的依据。
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器 日本岛津SPD-20A液相色谱仪；柱温箱CTO-20AC；超纯水仪UPR-5T；超声波清洗器KQ-500DE；天平METTLER MS105DU；硫酸黏菌素标准品来源：Council of Europe；水为超纯水，乙腈为色谱纯。
1.2 色谱条件 流动相：称取无水硫酸钠13.38g用纯化水稀释至2700mL，用稀磷酸调节pH至2.3～2.5，加水稀释至3000mL，再加乙腈846mL，摇匀，过滤，即得。色谱柱：菲罗门 C18 5u 4.6×250mm，检测波长：215nm，流速：1.0mL/min，柱温：30℃，进样量：20μL。 1.3 对照品溶液的配制 稀释液：20%乙腈水。对照储备液：精密称取对照品230mg（实际称量重量：230.51mg，对照品含量87.2%），以稀释液溶解并稀释至50mL，制成约4mg/mL的对照储备液。取上述对照储备液10.0mL到100mL容量瓶中，加稀释液定容，制成约0.4mg/mL的对照液。
1.4 樣品溶液的配制 精密称取50mg试样到100mL容量瓶中，加稀释液适量溶解，定容，过滤即得。
1.5 系统适用性试验 取上述0.4mg/mL的对照溶液20μL分别按本次试验色谱条件下进样，测定并计算柱效、分离度和拖尾因子（具体数据见表1）。
1.6 线性实验 取上述照品储备溶液分别稀释成0.2mg/mL、0.32mg/mL、0.4mg/mL、0.48mg/mL、0.6mg/mL的系列对照品溶液，按1.2色谱条件测定，以峰面积对浓度进行回归，多黏菌素E1：Y=3E-07X（R=0.9995）、多黏菌素E2：Y=4E-07X（R=0.9998）、多黏菌素E3：Y=3E-06X（R=0.9999）、多黏菌素EI-1：Y=3E-05X（R=0.9992）、多黏菌素EI-7MOA：Y=2E-05X（R=0.9996）说明硫酸黏菌素在0.2～0.6mg/mL范围内具有良好的线性关系（具体见图1～图5）。
1.7 重复性试验 精密吸取同一供试品溶液，按1.2项色谱条件测定，进样6次，得多黏菌素E1面积的RSD为0.2%、多黏菌素E2面积RSD为0.2%、多黏菌素E3面积RSD为0.8%、多黏菌素EI-1面积RSD为0.6%、多黏菌素EI-7MOA面积RSD为0.5%，表明样品重复性良好。具体见表2。
1.8 回收率试验 精密取已知含量的同一批样品（约25mg（共9份）置于100mL容量瓶中，分别加入上述1.3.2项下对照储备液3mL、5mL、7mL，按上述1.4项要求处理，进样测定，样品硫酸黏菌素的回收率为100.0%，具体见表3。
2 结论
本实验建立了HPLC法测定硫酸黏菌素组分含量的方法，测定色谱条件为：色谱柱为菲罗门C18 5u4.6*250mm，流动相为称取无水硫酸钠13.38g用纯化水稀释至2700mL，用稀磷酸调节pH至2.3～2.5，加水稀释至3000mL，再加乙腈846mL，摇匀，过滤，即得。流速为1.0mL/min，检测波长为215nm，在0.2～0.6mg/mL范围内线性关系良好。该方法具有线性范围宽、分析时间短、样品前处理简便、定量结果准确、重现性好等特点，为其质量控制提供了依据。
（责编：张宏民）