结核病是严重的公共健康问题之一，而耐药结核病的增加是控制结核病流行的难点之一。快速、准确的诊断是提高结核患者治愈率和降低死亡率的关键因素。本研究建立了基于二代测序技术的扩增子测序方法，对5种一线抗结核药物的17个耐药基因进行检测。在26个临床耐药结核菌株中共鉴定出65个突变，包括33个热点突变，9个稀有突变和23个新突变。对18个新发现的错义突变进行了蛋白质序列保守性和蛋白质局部结构的分析。结果表明，14个新的错义突变在9种分枝杆菌中显示出高度保守性，并且导致了该蛋白质局部结构的改变。根据本研究检测和分析结果，推测这些新发现的突变可能是潜在的耐药突变。在本研究中，构建了扩增子测序的检测方法，可同时检测10株临床结核菌株的17个耐药基因，是一种快速、准确并且全面的检测耐药结核分枝杆菌一线治疗药物耐药突变的方法，该方法不仅能检测热点突变和稀有突变，还能发现一些未报道过的新突变。该检测方法或可用于临床诊断和基础研究。