探讨高浓度草酸作用下HK－2细胞系中外泌体提取与鉴定的方法。
方法2016年6月至2017年1月进行实验。配制含草酸浓度分别为0、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、5.00、8.00、10.00 mmol/L的DMEM/F12无血清培养基，分别对HK－2细胞干预48 h，然后用CCK－8法检测不同浓度草酸对HK－2细胞生存率的影响。结合倒置显微镜下观察细胞的形态学变化，选择2.00 mmol/L的草酸作为实验浓度。用2.00 mmol/L草酸对HK－2细胞系干预48 h，收集干预后的HK－2细胞系的上清液，采用超速离心法提取外泌体；透射电镜观察外泌体的形态、大小；Nanosight系统检测外泌体的粒径与分布；蛋白质印迹法检测外泌体特异性蛋白HSP70、CD63的表达。
结果CCK－8法检测结果显示0、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、5.00、8.00、10.00 mmol/L组细胞的生存率分别为(100.0±4.0)%、(97.7±1.5)%、(97.3±2.1)%、(87.7±2.1)%、(76.0±1.0)%、(58.1±2.6)%、(52.7±1.5)%、(37.7±3.2)%、(31.3±2.0)%。透射电镜下外泌体呈杯口状，包膜为典型的双层膜结构。Nanosight系统显示2.00 mmol/L组外泌体峰值粒径为56 nm，整体平均粒径为87 nm，粒径为30～150 nm的比例为91.2%。蛋白质印迹法检测结果显示外泌体中明显表达HSP70和CD63蛋白，提取外泌体后的HK－2细胞表达HSP70蛋白，不表达CD63蛋白。
结论2.00 mmol/L草酸作用HK－2细胞48 h后，可以通过超速离心法提取丰富的、较高纯度的外泌体，这将为后续深入研究高浓度草酸背景下外泌体的信号转导奠定基础。