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摘要：以女贞子为原料，乙醇溶液为溶剂，超声辅助提取女贞子中的齐墩果酸；通过单因素试验对影响女贞子中齐墩果酸得率的料液比、提取时间、提取温度以及乙醇浓度进行探讨，在此基础上以正交试验优化工艺条件。结果表明，当料液比为1 ∶8、提取时间为30 min、提取温度为30 ℃、乙醇浓度为85%时，齐墩果酸的得率达到258%；女贞子中齐墩果酸对1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH自由基）具有一定的清除能力，当齐墩果酸浓度达到 10 mg/mL 时，齐墩果酸对DPPH自由基的清除率高达8580%。
关键词：女贞子；齐墩果酸；超声；提取；抗氧化活性
中图分类号： R2842文献标志码：
文章编号：1002-1302（2017）16-0174-03
收稿日期：2016-04-14
基金项目：江苏省大学生实践创新训练计划（编号：201512806013Y）。
作者简介：王莹（1983—），女，硕士，讲师，主要从事药物分析研究。Tel：（0523）86158186；E-mail：wonderful899@126com。
中药材女贞子是木樨科女贞、大叶女贞的干燥成熟果实，主要分布在浙江省、江苏省、湖南省等地。女贞子中含有齐墩果酸、多糖、熊果酸、氨基酸、挥发油等成分，其中重要的生物活性成分齐墩果酸具有护肝肾、抗病毒、抗炎、强心、利尿、抗肿瘤、降血糖以及镇静等作用，广泛应用于食品、医药、化妆品等领域[1-5]。本研究以女贞子为原料，以乙醇溶液为溶剂，采用单因素和正交试验对女贞子中齐墩果酸的提取工艺进行了优化，并研究了齐墩果酸的抗氧化活性。
1材料与方法
11材料
111原料处理
本试验采用来自浙江省温州市经炮制过的女贞子原料。在60 ℃条件下真空干燥，采用多功能粉碎机粉碎，过20目筛，密封贮藏，备用。
112试剂与仪器
齐墩果酸标准品（色谱纯HPLC≥98%，成都艾科达化学试剂有限公司），其余试剂均为市售分析纯。
HK-02A多功能粉碎机（上海烨昌食品机械有限公司）、BSA124S电子天平（赛多利斯）、KH-400KDV数控超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）、UV754N紫外-可见分光光度计（上海精科仪器有限公司）、RE-52旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）、HH-1数显恒温水浴锅（金坛市杰瑞尔电器有限公司）、M100 10 ～100 μL移液枪（宁波市群安实验室仪器有限公司）
12方法
121标准曲线的绘制
根据邸金明等对齐墩果酸含量测定方法的研究，本试验选择紫外分光光度法测定齐墩果酸的含量，选定的检测波长为215 nm。
准确称取齐墩果酸标准品0060 0 g至100 mL容量瓶中，用甲醇溶解后定容，摇匀，作为标准品溶液（浓度为 060 mg/mL）。分别移取齐墩果酸标准品溶液050、100、150、200、250 mL至10 mL容量瓶中，加甲醇定容，摇匀。在215 nm处分别测定其吸光度。以齐墩果酸标准品浓度（mg/L）对吸光度绘制标准曲线，进行线性回归得标准曲线方程，D215 nm=0005 6C 0021 6，r2=0995。结果表明，当齐墩果酸浓度在30～150 mg/L范围内时与吸光度具备良好的线性关系。
122超声波辅助提取
准确称取50 g干燥的女贞子粉末于250 mL具塞锥形瓶中，加入一定量的乙醇，按照设定的温度、时间进行超声辅助提取，提取结束后，减压抽滤，旋蒸，除去乙醇，得浸膏，将浸膏分散于10 mL蒸馏水中，用适量水饱和的正丁醇分3次进行萃取，收集萃取液，再次用旋转蒸发仪除去正丁醇直至无醇味，用甲醇溶解并定容于50 mL容量瓶中。准确移取050 mL提取液稀释定容至10 mL，按“121”法进行测定。
女贞子中齐墩果酸得率=溶液中齐墩果酸的浓度×稀释倍数×定容体积/女贞子粉末质量×100%=（D215 nm-0021 6）/0005 6×（10/050）×50×10-6/50×100%。
123女贞子中齐墩果酸的抗氧化作用试验
准确吸取 020 mL 不同浓度的女贞子齐墩果酸提取液于比色管中，加入预先配制好的4 mL 015 mmol/L的1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH自由基）甲醇溶液，摇匀后暗处放置 30 min，以样品溶剂为对照，测定其在525 nm处的吸光度D，同时测定样品溶液在525 nm处的吸光度D0及DPPH甲醇溶液在525 nm处的吸光度D1[7-9]。
[JZ]清除率=[1-（D-D0）/D1]×100%。
2结果与分析
21单因素试验
211料液比对提取齐墩果酸的影响
准确称取50 g女贞子粉末5份，分别加入30、35、40、45、50 mL 90%乙醇（即料液比分别为1 ∶6、1 ∶7、1 ∶8、1 ∶9、1 ∶10，g ∶mL），在30 ℃下超声30 min提取，结果见图2。
由图2可知，随着料液比的增大，从女贞子中提取齐墩果酸的得率逐步提高，当料液比达到1 ∶8时，齐墩果酸得率达到峰值，之后基本保持不变。这是由于料液比较小时，乙醇溶液与药材间浓度梯度小，传质推动力相应较小[10]，齐墩果酸沒有全部溶出，当料液比达到1 ∶8时，齐墩果酸基本溶出。
212超声时间对提取游离齐墩果酸的影响
准确称取 50 g 女贞子粉末5份，倒入具塞锥形瓶中，各加入40 mL 90%乙醇，在30 ℃条件下分别超声0、15、30、45、60 min。由图3可见，齐墩果酸的得率随着超声时间的增长不断增加，超声时间超过30 min后，齐墩果酸的得率趋于稳定。 [FK（W11][TPWY3333tif][FK）]
在传统醇提工艺中，女贞子中齐墩果酸的回流提取时间长达2～3 h[10-11]。与传统工艺相比，超声缩短了提取所需时间，效率大幅度提高。这可能是由于超声的空化作用有效地击破了植物细胞壁，使得细胞的通透性显著增大，加速齐墩果酸溶入乙醇溶液中[12]。
213提取温度对提取游离齐墩果酸的影响
准确称取 50 g 女贞子粉末5份，各加入40 mL 90%乙醇，分别在20～60 ℃条件下超声30 min，结果见图4。
[FK（W11][TPWY4444tif][FK）]
由图4可知，提取温度在20～40 ℃内，女贞子中齐墩果酸的得率随着提取温度的升高而略有增大，当温度超过 40 ℃，齐墩果酸的得率基本不变。
214乙醇浓度对提取游离齐墩果酸的影响
准确称取 50 g 女贞子粉末5份，分别加入40 mL浓度为80%、85%、90%、95%、100%的乙醇，在超声温度30 ℃、提取时间30 min条件下进行超声提取，结果见图5。
由图5可见，在其他条件不变的情况下，随着乙醇浓度的增大，齐墩果酸的得率先增大后减小，当乙醇浓度为85%时，齐墩果酸的得率最高。这是由于齐墩果酸在50%～85%乙醇溶液中，溶解度随醇浓度的升高而增加，即醇浓度升高有利于齐墩果酸的溶出；但当乙醇体积分数超过85%时，高浓度的乙醇溶液具有强烈的吸水作用，影响女贞子细胞的溶胀，抑制齐墩果酸的释放，从而导致齐墩果酸得率下降[14]。
22女贞子中齐墩果酸提取条件的优化
221正交试验
在单因素试验的基础上，以料液比（A）、提取时间（B）、提取温度（C）、乙醇浓度（D）为因素，采取 L9（34） 正交进行试验，正交设计见表1，所得结果见表2。以齐墩果酸的得率为指标，通过直观分析正交试验的结果，优化女贞子中齐墩果酸的最佳提取条件。
声时间对女贞子中齐墩果酸得率的影响最大，料液比次之。由正交试验结果可知，较优的提取条件为A3B2C1D2，即料液比为1 g ∶8 mL、超声时间为30 min、提取温度为30 ℃、乙醇浓度为85%。
222验证试验结果
采用正交试验确定的优化条件进行提取，女贞子中齐墩果酸得率平均达258%（表3），高于表2中所有试验组合的齐墩果酸得率。
23女贞子中游离齐墩果酸的抗氧化活性
女贞子中游离的齐墩果酸对DPPH自由基具有一定的清除能力，且清除能力与齐墩果酸浓度呈现明显的量效关系（图6），即随着齐墩果酸浓度的升高，对DPPH自由基的清除能力不断升高。当齐墩果酸浓度为02 mg/mL时，齐墩果酸对DPPH自由基的清除率最小，仅有2720%。而当齐墩果酸浓度达到10 mg/mL时，齐墩果酸对DPPH自由基的清除率高达8580%，且趋于稳定。
3结论与讨论
本试验采用超声辅助提取女贞子中的齐墩果酸，在提取过程中，料液比、超声时间、提取温度以及乙醇浓度等因素均能直接影响齐墩果酸的得率。与传统溶剂提取法相比，超声辅助提取无需高温，提取效率高。当料液比为1 g ∶8 mL、超声时间为30 min、提取温度为30 ℃、乙醇浓度为85%时，齐墩果酸得率为258%。齊墩果酸对DPPH具有较好的清除能力，清除能力随着齐墩果酸质量浓度的增加而增强，当质量浓度为10 mg/mL时， 齐墩果酸对DPPH自由基的清除率高达8580%。
参考文献：
吕佳飞，李文飞，冯伟，等 微波法提取红枣中齐墩果酸的工艺条件优化研究[J] 化工技术与开发，2010，39（6）：21-24
陈秋实，吴杰，李威，等 从木瓜成叶中提取齐墩果酸及羟丙基-β-环糊精包合工艺研究[J] 中药材，2010，3（5）：804-806
[3]刘智华 女贞子齐墩果酸的提取及其降血糖作用研究[D] 杨凌：西北林业科技大学，2007
[4]吴林蔚，蒲蔷，陈晓珍，等 齐墩果酸对卵巢癌细胞IGROV1和乳腺细胞MDA-MB-231生长的抑制作用[J] 应用与环境生物学报，2010，16（2）：202-204
[5]赵龙铉，贺兴隆，金礼吉，等 齐墩果酸和甘草次酸衍生物的合成与表征及抗癌活性研究[J] 辽宁师范大学学报（自然科学版），2010，33（4）：474-476
[6]邸金明，刘彬彬，赵婧，等 齐墩果酸5种含量测定方法的比较研究[J] 西北药学杂志，2013，28（5）：483-486
[7]王兴娜，汪晶，黄午阳，等 青梅果实不同极性组分的抗氧化活性[J] 江苏农业学报，2016，32（1）：211-215
[8]彭长连，陈少薇，林植芳，等 用清除有机自由基DPPH法评价植物抗氧化能力[J] 生物化学与生物物理进展，2000，27（6）：658-661
[9]朱海军，生静雅，张普娟，等 贮藏温度对薄壳山核桃抗氧化功能及品质的影响[J] 江苏农业学报，2015，31（2）：449-453
[10]黄湘兰，彭拓华 正交试验对女贞子提取工艺的优选[J] 中药材，2000，23（10）：644-645
[11]郭宇洁，任烨，葛争艳，等 正交试验法比较女贞子中齐墩果酸与特女贞苷的乙醇提取工艺[J] 中成药，2013，35（2）：277-281
[12]杨义芳，孔德云 中药提取分离新技术[M] 北京：化学工业出版社，2010
[13]唐凤翔，朱忠敏，李小虎 乙醇-水体系中齐墩果酸的溶解度和反应结晶介稳区[J] 高校化学工程学报，2011，25（5）：893-896
[14]王莹，王华，张龙，等 响应面法优化朝天椒中辣椒碱类物质的提取工艺[J] 中国调味品，2015，40（3）：37-41
关键词：女贞子；齐墩果酸；超声；提取；抗氧化活性
中图分类号： R2842文献标志码：
文章编号：1002-1302（2017）16-0174-03
收稿日期：2016-04-14
基金项目：江苏省大学生实践创新训练计划（编号：201512806013Y）。
作者简介：王莹（1983—），女，硕士，讲师，主要从事药物分析研究。Tel：（0523）86158186；E-mail：wonderful899@126com。
中药材女贞子是木樨科女贞、大叶女贞的干燥成熟果实，主要分布在浙江省、江苏省、湖南省等地。女贞子中含有齐墩果酸、多糖、熊果酸、氨基酸、挥发油等成分，其中重要的生物活性成分齐墩果酸具有护肝肾、抗病毒、抗炎、强心、利尿、抗肿瘤、降血糖以及镇静等作用，广泛应用于食品、医药、化妆品等领域[1-5]。本研究以女贞子为原料，以乙醇溶液为溶剂，采用单因素和正交试验对女贞子中齐墩果酸的提取工艺进行了优化，并研究了齐墩果酸的抗氧化活性。
1材料与方法
11材料
111原料处理
本试验采用来自浙江省温州市经炮制过的女贞子原料。在60 ℃条件下真空干燥，采用多功能粉碎机粉碎，过20目筛，密封贮藏，备用。
112试剂与仪器
齐墩果酸标准品（色谱纯HPLC≥98%，成都艾科达化学试剂有限公司），其余试剂均为市售分析纯。
HK-02A多功能粉碎机（上海烨昌食品机械有限公司）、BSA124S电子天平（赛多利斯）、KH-400KDV数控超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）、UV754N紫外-可见分光光度计（上海精科仪器有限公司）、RE-52旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）、HH-1数显恒温水浴锅（金坛市杰瑞尔电器有限公司）、M100 10 ～100 μL移液枪（宁波市群安实验室仪器有限公司）
12方法
121标准曲线的绘制
根据邸金明等对齐墩果酸含量测定方法的研究，本试验选择紫外分光光度法测定齐墩果酸的含量，选定的检测波长为215 nm。
准确称取齐墩果酸标准品0060 0 g至100 mL容量瓶中，用甲醇溶解后定容，摇匀，作为标准品溶液（浓度为 060 mg/mL）。分别移取齐墩果酸标准品溶液050、100、150、200、250 mL至10 mL容量瓶中，加甲醇定容，摇匀。在215 nm处分别测定其吸光度。以齐墩果酸标准品浓度（mg/L）对吸光度绘制标准曲线，进行线性回归得标准曲线方程，D215 nm=0005 6C 0021 6，r2=0995。结果表明，当齐墩果酸浓度在30～150 mg/L范围内时与吸光度具备良好的线性关系。
122超声波辅助提取
准确称取50 g干燥的女贞子粉末于250 mL具塞锥形瓶中，加入一定量的乙醇，按照设定的温度、时间进行超声辅助提取，提取结束后，减压抽滤，旋蒸，除去乙醇，得浸膏，将浸膏分散于10 mL蒸馏水中，用适量水饱和的正丁醇分3次进行萃取，收集萃取液，再次用旋转蒸发仪除去正丁醇直至无醇味，用甲醇溶解并定容于50 mL容量瓶中。准确移取050 mL提取液稀释定容至10 mL，按“121”法进行测定。
女贞子中齐墩果酸得率=溶液中齐墩果酸的浓度×稀释倍数×定容体积/女贞子粉末质量×100%=（D215 nm-0021 6）/0005 6×（10/050）×50×10-6/50×100%。
123女贞子中齐墩果酸的抗氧化作用试验
准确吸取 020 mL 不同浓度的女贞子齐墩果酸提取液于比色管中，加入预先配制好的4 mL 015 mmol/L的1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH自由基）甲醇溶液，摇匀后暗处放置 30 min，以样品溶剂为对照，测定其在525 nm处的吸光度D，同时测定样品溶液在525 nm处的吸光度D0及DPPH甲醇溶液在525 nm处的吸光度D1[7-9]。
[JZ]清除率=[1-（D-D0）/D1]×100%。
2结果与分析
21单因素试验
211料液比对提取齐墩果酸的影响
准确称取50 g女贞子粉末5份，分别加入30、35、40、45、50 mL 90%乙醇（即料液比分别为1 ∶6、1 ∶7、1 ∶8、1 ∶9、1 ∶10，g ∶mL），在30 ℃下超声30 min提取，结果见图2。
由图2可知，随着料液比的增大，从女贞子中提取齐墩果酸的得率逐步提高，当料液比达到1 ∶8时，齐墩果酸得率达到峰值，之后基本保持不变。这是由于料液比较小时，乙醇溶液与药材间浓度梯度小，传质推动力相应较小[10]，齐墩果酸沒有全部溶出，当料液比达到1 ∶8时，齐墩果酸基本溶出。
212超声时间对提取游离齐墩果酸的影响
准确称取 50 g 女贞子粉末5份，倒入具塞锥形瓶中，各加入40 mL 90%乙醇，在30 ℃条件下分别超声0、15、30、45、60 min。由图3可见，齐墩果酸的得率随着超声时间的增长不断增加，超声时间超过30 min后，齐墩果酸的得率趋于稳定。 [FK（W11][TPWY3333tif][FK）]
在传统醇提工艺中，女贞子中齐墩果酸的回流提取时间长达2～3 h[10-11]。与传统工艺相比，超声缩短了提取所需时间，效率大幅度提高。这可能是由于超声的空化作用有效地击破了植物细胞壁，使得细胞的通透性显著增大，加速齐墩果酸溶入乙醇溶液中[12]。
213提取温度对提取游离齐墩果酸的影响
准确称取 50 g 女贞子粉末5份，各加入40 mL 90%乙醇，分别在20～60 ℃条件下超声30 min，结果见图4。
[FK（W11][TPWY4444tif][FK）]
由图4可知，提取温度在20～40 ℃内，女贞子中齐墩果酸的得率随着提取温度的升高而略有增大，当温度超过 40 ℃，齐墩果酸的得率基本不变。
214乙醇浓度对提取游离齐墩果酸的影响
准确称取 50 g 女贞子粉末5份，分别加入40 mL浓度为80%、85%、90%、95%、100%的乙醇，在超声温度30 ℃、提取时间30 min条件下进行超声提取，结果见图5。
由图5可见，在其他条件不变的情况下，随着乙醇浓度的增大，齐墩果酸的得率先增大后减小，当乙醇浓度为85%时，齐墩果酸的得率最高。这是由于齐墩果酸在50%～85%乙醇溶液中，溶解度随醇浓度的升高而增加，即醇浓度升高有利于齐墩果酸的溶出；但当乙醇体积分数超过85%时，高浓度的乙醇溶液具有强烈的吸水作用，影响女贞子细胞的溶胀，抑制齐墩果酸的释放，从而导致齐墩果酸得率下降[14]。
22女贞子中齐墩果酸提取条件的优化
221正交试验
在单因素试验的基础上，以料液比（A）、提取时间（B）、提取温度（C）、乙醇浓度（D）为因素，采取 L9（34） 正交进行试验，正交设计见表1，所得结果见表2。以齐墩果酸的得率为指标，通过直观分析正交试验的结果，优化女贞子中齐墩果酸的最佳提取条件。
声时间对女贞子中齐墩果酸得率的影响最大，料液比次之。由正交试验结果可知，较优的提取条件为A3B2C1D2，即料液比为1 g ∶8 mL、超声时间为30 min、提取温度为30 ℃、乙醇浓度为85%。
222验证试验结果
采用正交试验确定的优化条件进行提取，女贞子中齐墩果酸得率平均达258%（表3），高于表2中所有试验组合的齐墩果酸得率。
23女贞子中游离齐墩果酸的抗氧化活性
女贞子中游离的齐墩果酸对DPPH自由基具有一定的清除能力，且清除能力与齐墩果酸浓度呈现明显的量效关系（图6），即随着齐墩果酸浓度的升高，对DPPH自由基的清除能力不断升高。当齐墩果酸浓度为02 mg/mL时，齐墩果酸对DPPH自由基的清除率最小，仅有2720%。而当齐墩果酸浓度达到10 mg/mL时，齐墩果酸对DPPH自由基的清除率高达8580%，且趋于稳定。
3结论与讨论
本试验采用超声辅助提取女贞子中的齐墩果酸，在提取过程中，料液比、超声时间、提取温度以及乙醇浓度等因素均能直接影响齐墩果酸的得率。与传统溶剂提取法相比，超声辅助提取无需高温，提取效率高。当料液比为1 g ∶8 mL、超声时间为30 min、提取温度为30 ℃、乙醇浓度为85%时，齐墩果酸得率为258%。齊墩果酸对DPPH具有较好的清除能力，清除能力随着齐墩果酸质量浓度的增加而增强，当质量浓度为10 mg/mL时， 齐墩果酸对DPPH自由基的清除率高达8580%。
参考文献：
吕佳飞，李文飞，冯伟，等 微波法提取红枣中齐墩果酸的工艺条件优化研究[J] 化工技术与开发，2010，39（6）：21-24
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[6]邸金明，刘彬彬，赵婧，等 齐墩果酸5种含量测定方法的比较研究[J] 西北药学杂志，2013，28（5）：483-486
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