【摘 要】
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旨在原核表达犬冠状病毒（CCoV）的刺突（S）蛋白，以此为包被抗原，通过优化条件建立CCoV血清抗体间接ELISA检测方法。首先，将CCoV的S基因序列克隆至原核表达载体pCold I中，在大肠杆菌BL21（DE3）中经IPTG诱导表达。Western-blot验证蛋白大小约为28 ku，纯化后作为包被抗原，通过优化条件建立检测CCoV抗体的间接ELISA，抗原包被最佳质量浓度为4μg/mL；待检
【机 构】
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中国农业科学院特产研究所农业农村部经济动物疫病重点实验室
【基金项目】
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国家自然科学基金项目（32100408）； 吉林省科技发展计划项目（20210202050NC）；
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旨在原核表达犬冠状病毒（CCoV）的刺突（S）蛋白，以此为包被抗原，通过优化条件建立CCoV血清抗体间接ELISA检测方法。首先，将CCoV的S基因序列克隆至原核表达载体pCold I中，在大肠杆菌BL21（DE3）中经IPTG诱导表达。Western-blot验证蛋白大小约为28 ku，纯化后作为包被抗原，通过优化条件建立检测CCoV抗体的间接ELISA，抗原包被最佳质量浓度为4μg/mL；待检血清稀释度为1︰160时D450最高；酶标抗体最佳稀释度为1︰3000；TMB最佳显色时间为20 min；最佳封闭液为50 g/L脱脂奶粉溶液；阴阳性临界值D450＝0.214；与犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬腺病毒的阳性血清均不发生交叉反应，表明特异性好；批内变异系数最大值为4.531％，批间变异系数最大值为2.908％，表明重复性好；该方法能检测到640倍稀释的血清，表明敏感性较高。应用该方法对临床161份犬血清进行检测，发现阳性率为98.7%，说明CCoV的感染率较高。本研究为CCoV抗体检测提供了有效工具。
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