【背景】猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）、猪圆环病毒三型（porcine circovirus type Ⅲ,PCV3）和猪流感病毒（swine influenza virus,SIV）是3种影响猪只健康的重要呼吸道病原，对养猪业造成严重的经济损失，因此需要建立高效快速的检测方法，以了解3种病原在国内的流行情况。【目的】建立能同时检测PRRSV、PCV3和SIV的三重RT-PCR方法，为3种病毒的流行病学调查和疾病监控提供技术支持。【方法】针对猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV），猪圆环病毒三型（PCV3），猪流感病毒（SIV）基因序列，分别设计3对特异性引物，扩增PRRSV M和N基因（436 bp）、PCV3 Cap基因（619 bp）和SIV M基因（199 bp）。通过对退火温度和引物浓度优化建立三重RT-PCR检测方法，并对建立的多重检测方法进行特异性、敏感性、重复性试验验证。【结果】建立了能够同时快速检测PRRSV、PCV3、SIV的三重RT-PCR方法，而对猪瘟病毒（classical swine fever virus,CSFV）、猪伪狂犬病病毒（pseudorabies virus,PRV）、猪圆环病毒2型（porcine circovirus type Ⅱ,PCV2）、猪细小病毒2型（porcine parvovirus Ⅱ,PPV2）、猪细小病毒3型（porcine parvovirus Ⅲ,PPV3）和猪细环病毒1型（torque teno sus virus I,TTSuV1）等6种病原的扩增均为阴性，特异性较好。敏感性结果显示，同时检测PRRSV、PCV3、SIV这3种病原的检测下限为100copies/μL，批间与批内试验结果均一致。用该方法对黑龙江省部分地区猪场的67份临床病料进行检测，结果显示PRRSV阳性率为16.5%,PCV3阳性率为10.5%,SIV阳性率为10.5%，而且存在混合感染。【结论】该方法灵敏度高、特异性强，能够应用于临床样品检测，有效预测病原的流行情况。