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摘 要：转基因技术是将人工分离和修饰过的基因导入目标生物体基因组中，达到改造生物体的目的。近些年随着研究的不断深入，植物基因工程得到了很大的发展。植物基因工程是大豆遗传改良的的重要途径。近几年来转基因植物与日俱增，转化方法也得到了快速的发展。从大豆组织培养研究进展、大豆遗传转化研究进展、大豆遗传转化面临的问题和展望三个方面对大豆基因工程进展作以综述。
关键词：大豆 遗传转化 组织培养 研究现状
中图分类号：Q31 文献标识码：A 文章编号：1007-3973（2012）008-091-02
作为粮食与饲料以及油料的重要农作物——大豆，对人们的生活起着重要的作用。大豆是全世界食用油以及植物蛋白的重要成分和来源。在每一粒大豆种子中都能提取出40%左右的蛋白质，20%左右的油脂等等。从大豆中提取的油脂量占据目前全世界油脂总量的48%。这样的比例占据所有颗粒类型油料农作物的首要地位。大豆产出的油脂有众多作用，在工业中，主要应用于颜料，这些颜料应用广泛，可以在生产绘图中采用，我们日常应用的打印墨也来自于油脂的再加工，还有肥皂、各种消毒以及杀虫的药剂等等。大豆的油脂在工业中的应用还可以产生须有高价值的副产品，例如磷酸卵磷脂，它可以在食品、化妆品、油漆、制药、洗涤等等方面起到保湿以及稳定的效果。大豆中大量的蛋白可以做成纤维、防水、防火等用品。从50年代起，世界上对大豆的需求一直呈增长势头，大豆已跻身于世界主要商品农作物之林。随着我国农业科技化的不断发展，农业耕作者对于大豆品种的选择与培育投入了大量的人力、物力、财力等等，并在大豆品种的改良上效果显著。然而，按照以往模式的培育种子技术受到很大的局限性，按照旧模式来培育年限太长，很难解决性状连锁以及多基因重新组合效率低下、远缘杂交困难等等困扰。随着生物学逐步进入分子生物学时代，应用转基因的新型技术已经在改善不同种类种子的性状上实现了预期的效果，并应用了以转基因技术为总体核心技术，这样的植物基因工程培育种子的技能已经使生殖隔离，展现了遗传物质在不同物种之间的转变，这巨大的改变使大豆的育种工作迈向了新的台阶。同时，由于大豆具有生物固氮等重要的生物学功能，大豆功能基因组的研究也已为人们所关注，发展与大豆重要地位相匹配的，高效的大豆再生和分子遗传转化系统已经成为迫切需要。我们再来看水稻与烟草等农作物，从大豆的改良中的再生系统的高效性与遗传转化系统建设的成效就能体会到植物基因的工程领域中难以突破之处，我们要在这重点与难点见不断探究，深入分析，本文将从以下三个方面对大豆基因工程进展作以综述：(1)大豆组织培养研究进展；(2)大豆遗传转化研究进展；(3)大豆遗传转化面临的问题和展望。
1 大豆组织培养研究进展
优良的大豆组织培养再生系统是实现大豆高效遗传转化的前提和必要条件。在20世纪60年代左右，我国才开始研究大豆的组织培养，众观整个发展过程，不同种类的外部植体的组织培养都很困难，同时我们也认识到了再生植株的培养也非常困难。在困难中前行，通过20多年的探索，到了80年代中后期左右，农业学家终于在大豆组织培养工作中取得的巨大地进展。我们根据再生的途径的异同点来区分：大豆原生质体与单细胞组织培养与植株再生；大豆器官发生与植株再生；大豆体细胞胚胎发生与植株再生。
1.1 植株再生与大豆原生质体以及单细胞组织培养
自从20世纪60年代开始，Cocking利用酶法成功分离出高等植物原生质体，许多学者专家们也开始试验分离与培养豆科植物的原生质体。追溯根源，大豆原生质体培养最早的研究者是Kao等，这些植物学家从从悬浮细胞游离原生质体从而获得愈伤组织，自此，植物学家们以及研究学者开始了大量研究大豆原生质体的培养。在未成熟子叶、成熟子叶和下胚轴游离出原生质体经培养获得愈伤组织。我们看到大豆原生质体培养获得再生植株研究的成功报道是Wei和Xu等，1988年世界上首次报道再生植株研究成功是源于大豆原生质体培养而获得的，在中国的植株再生发展进程中，卫志明等来自于中国科学院上海植物生理研究所的学者通过大豆原生质体培养经由器官发生途径从而成功获取87株大豆再生植株。其后，来自美国的Dhir和罗希明等，南京农业大学吕慧能等也经此途径获得再生植株。
1.2 大豆器官发生与植株再生
器官发生再生系统是指通过激素等因素诱导具有不定芽发生潜能的外植体位点使其再生植株的再生系统。Cheng等在20世纪80年代采用无菌的苗子叶节第一次成功的培育并获得了再生植株，随着科学技术的不断发展，随后就相继出现了一些大豆再生植株利用一些经器官所产生的相关报道。
1.3 植株再生以及大豆体细胞胚胎发生
在一定的条件下，双倍或者是单位体的体细胞没有经过性细胞的结合只通过与合子胚产生相似的途径发育出相似的合子胚的过程就叫做体细胞胚胎发生(称为体细胞胚或胚状体或体胚的形态发生过程)。体细胞胚可以进一步萌发形成新的个体，并发育为小植株。大豆的未成熟的子叶、未成熟胚胎以及下胚轴等是大豆体细胞胚胎发生常用的外植体。
2 大豆遗传转化的研究进展
2.1 农杆菌介导的大豆遗传转化
在我国农业经济迅速发展的今天，大豆遗体转化方式也分为花粉管通道法、电击法、农杆菌介导法、子房注射法、农杆菌介导和基因枪结合转化法、基因枪法、超声波辅助农杆菌介导法等等。在本文中，主要提到的是三种方法：第一是农杆菌介导法，第二是基因枪法，第三是花粉管通道法。植物遗传转化的农杆菌常采用包括土壤根癌农杆菌以及发根农杆菌。叶盘转化法与整体植株接种共感染法是构成农杆菌转化的主要方法。我们所说的叶盘转化法就是由Horsch等实验出来的一种转化方法，其具体的食用方法就是先用打孔器把消毒叶片上所获得的叶圆片叫做叶盘。在我国目前的应用当中，大豆农杆菌转化大部分是选取改良叶盘法外植体主要依靠子叶、子叶节与下胚轴等等。
2.2 基因枪法大豆遗传转化问题 在我国目前广为应用的转化方法就是基因枪转化法，它使用于一部分对于农杆菌不敏感的植物中。在这些不敏感的植物中包含许多单子叶植物与部分双子叶植物。
结果表明轰击不同的组织，轰击进入细胞层的深度也不同。Falco等用基因枪法获得一些游离赖氨酸增加几百倍的转基因大豆植株及高含量赖氨酸的种子。
2.3 大豆种质遗传转化系统
鉴于大豆离体再生以及遗传转化的高难度性，不经过离体组织培养的转化系统对解决大豆遗传转化面临的问题很有吸引力。通过我国植物科学家以及农业学家的不断试验与探究，共有两个重要的转化系统。其一就是通过花粉管通道方法来将高蛋白的野生大豆中总的DNA移入到大豆的栽培过程中，通过这样的过程来获得高产量高蛋白的大豆品种之一黑生。其二就是采用子房注射方式。刘博林等通过这种方法已经将atrazine抗性基因转入大豆叶绿体中并获得转化植株，岳绍先等将atrazine抗性基因的质粒逐步移入到大豆的受体中以此获取抗atrazineF123的转基因大豆。
3 大豆遗传转化问题以及前景展望
从成果上来看，大豆遗传转化技术已经取得了一定的成就，但是部分转基因大豆也已经商业化，但是总体来看，大豆的遗传转化在技术上远未成熟。具体到各种不同的转化方法，表现为：(1)建立在大豆器官发生再生体系基础上的大豆转化技术，虽然技术操作相对简单，但是嵌合体现象严重，筛选、纯化的难度大；(2)虽然大豆体细胞胚胎发生的再生体系被认为是解决大豆遗传转化中嵌合体问题的最具潜力的再生体系，但是目前面临农杆菌介导的转化不是很成功，以及长时间离体培养会造成体细胞变异等问题；(3)以大豆原生质体再生体系为基础的转化系统在理论上也有很大希望，并且逐渐改变大豆遗传转化的种种不良现象，然而我们所面临的现实问题就是系统进行的复杂性，掌握难度较大，工作任务较重，各种基因型所产生的差异巨大，再生的频率更加降低。(4)花粉管直接导入法是目前国内常用的方法之一，但是由于此方法的分子机理不是很清楚，因此在应用上还存在很大争议。总体来看，大豆和已经实现稳定遗传转化的植物一样，具有用来进行有效遗传转化的美好前景，但是目前还没有建立一种高效、稳定、快捷、简便的应用于大豆转化的再生体系，而现有的再生系统也不能与当前植物遗传转化方法很好的结合，这是限制大豆遗传转化技术发展的关键因素。同时研究转基因植株外源基因在植物体中的稳定表达和遗传，也是大豆遗传转化技术进一步发展道路上的一个重要命题。建立一个适合用于大豆遗传转化的有效再生受体系统，并在前人工作基础上对各种转化方法进行优化创新，摸索出一个高效的遗传转化新体系，才能实现规模化的大豆遗传转化，为改良大豆品质、提高大豆产量以及大豆功能基因组研究提供实质性的工具。
大豆遗传转化技术目前面临的另外一个生产方面的问题：生物安全性问题。近年来由于为转基因作物在发展市场的时候遇到了很多实质性的问题，尤其是欧洲国家的相关条例，非常反对使用转基因类的作物食品，这就为这些转基因作物寻找、进入市场带来了巨大的困难。这样的问题已经涉及到了生物安全性，我们一般从六个方面来看转基因作物的生物安全性，转移基因、杂草化、性状效应、遗传与表型的改变、病原遗传物质的表达和工作人员的人身安全。在这里面风险最大的就是杂草化了，这里面包括抗性作物本身的杂草化，抗性杂草的产生大部分原因要归结于抗性基因的飘移的副作用。同时也在整体环境的影响程度以及食品食用的安全问题，抗性基因所显露出的稳定因素，多种原因导致的抗性杂草的发生等等问题。我们也必须清醒的认识到，抗除草剂转基因作物的食品安全问题也有诸多不能预见的问题，在短暂的几年时间内不会做出特别肯定的答案，这是一项长期的工作，必须要靠长时间的监控才会取得精确的数据以及结果。从之前的试验中我们看出传统大豆的高温敏感性要低于转草甘膦大豆，再经历过遗传的填补之后仍然不能够取得高产量，也许会出现远远低于其他普通优良的品种产量。在动物食用草甘膦后会改变其自身体内的激素成分，从而破坏动物的生殖系统，究其原因，就在于草甘膦应用于豆科植物的时候会生成一种植物的雌激素，草甘膦的持续性很强，它会长期存在于土壤中，不溶解。这不仅危害了土壤中的动物，而且也会破坏以及污染地下水，并且进入恶性循环，从而导致破坏了土壤生化循环。除此之外，仅仅通过上述问题研究远远不能够就此得出转基因作物安全性的结论，我们还必须考虑到外源基因也是一个物种转移到另一物种过程中也会存在过敏的危险因素。
虽然大豆的遗传转化技术在前进的道路上面临种种问题，但是我们会利用现在已取得的成果来不断完善大豆的遗传转化技术。主要是在实验中不断应用大豆的离体再生体系，以及在应用过程中不断改善再生体系。其次是在研发与应用方面侧重大豆的转化体系，再次是通过进行识别与分离、克隆与使用新目标基因，以及整个基因大豆整个产业链的发展，在不久的将来，肯定会为我们生产出安全可靠地转基因类的大豆产品，以此来缓解人类在粮食产量以及产品质量问题以及环境污染问题等等。同时，我国大豆产业要与其他农作物一样，要加大生物科技的研发，创造出高效的、稳定的大豆遗传转化系统的安全大豆，我国应制定相应的标准与规范，实时监测，通过精确的数据统计，从而提升种植效益，不断加大我国大豆产业的核心竞争力。
关键词：大豆 遗传转化 组织培养 研究现状
中图分类号：Q31 文献标识码：A 文章编号：1007-3973（2012）008-091-02
作为粮食与饲料以及油料的重要农作物——大豆，对人们的生活起着重要的作用。大豆是全世界食用油以及植物蛋白的重要成分和来源。在每一粒大豆种子中都能提取出40%左右的蛋白质，20%左右的油脂等等。从大豆中提取的油脂量占据目前全世界油脂总量的48%。这样的比例占据所有颗粒类型油料农作物的首要地位。大豆产出的油脂有众多作用，在工业中，主要应用于颜料，这些颜料应用广泛，可以在生产绘图中采用，我们日常应用的打印墨也来自于油脂的再加工，还有肥皂、各种消毒以及杀虫的药剂等等。大豆的油脂在工业中的应用还可以产生须有高价值的副产品，例如磷酸卵磷脂，它可以在食品、化妆品、油漆、制药、洗涤等等方面起到保湿以及稳定的效果。大豆中大量的蛋白可以做成纤维、防水、防火等用品。从50年代起，世界上对大豆的需求一直呈增长势头，大豆已跻身于世界主要商品农作物之林。随着我国农业科技化的不断发展，农业耕作者对于大豆品种的选择与培育投入了大量的人力、物力、财力等等，并在大豆品种的改良上效果显著。然而，按照以往模式的培育种子技术受到很大的局限性，按照旧模式来培育年限太长，很难解决性状连锁以及多基因重新组合效率低下、远缘杂交困难等等困扰。随着生物学逐步进入分子生物学时代，应用转基因的新型技术已经在改善不同种类种子的性状上实现了预期的效果，并应用了以转基因技术为总体核心技术，这样的植物基因工程培育种子的技能已经使生殖隔离，展现了遗传物质在不同物种之间的转变，这巨大的改变使大豆的育种工作迈向了新的台阶。同时，由于大豆具有生物固氮等重要的生物学功能，大豆功能基因组的研究也已为人们所关注，发展与大豆重要地位相匹配的，高效的大豆再生和分子遗传转化系统已经成为迫切需要。我们再来看水稻与烟草等农作物，从大豆的改良中的再生系统的高效性与遗传转化系统建设的成效就能体会到植物基因的工程领域中难以突破之处，我们要在这重点与难点见不断探究，深入分析，本文将从以下三个方面对大豆基因工程进展作以综述：(1)大豆组织培养研究进展；(2)大豆遗传转化研究进展；(3)大豆遗传转化面临的问题和展望。
1 大豆组织培养研究进展
优良的大豆组织培养再生系统是实现大豆高效遗传转化的前提和必要条件。在20世纪60年代左右，我国才开始研究大豆的组织培养，众观整个发展过程，不同种类的外部植体的组织培养都很困难，同时我们也认识到了再生植株的培养也非常困难。在困难中前行，通过20多年的探索，到了80年代中后期左右，农业学家终于在大豆组织培养工作中取得的巨大地进展。我们根据再生的途径的异同点来区分：大豆原生质体与单细胞组织培养与植株再生；大豆器官发生与植株再生；大豆体细胞胚胎发生与植株再生。
1.1 植株再生与大豆原生质体以及单细胞组织培养
自从20世纪60年代开始，Cocking利用酶法成功分离出高等植物原生质体，许多学者专家们也开始试验分离与培养豆科植物的原生质体。追溯根源，大豆原生质体培养最早的研究者是Kao等，这些植物学家从从悬浮细胞游离原生质体从而获得愈伤组织，自此，植物学家们以及研究学者开始了大量研究大豆原生质体的培养。在未成熟子叶、成熟子叶和下胚轴游离出原生质体经培养获得愈伤组织。我们看到大豆原生质体培养获得再生植株研究的成功报道是Wei和Xu等，1988年世界上首次报道再生植株研究成功是源于大豆原生质体培养而获得的，在中国的植株再生发展进程中，卫志明等来自于中国科学院上海植物生理研究所的学者通过大豆原生质体培养经由器官发生途径从而成功获取87株大豆再生植株。其后，来自美国的Dhir和罗希明等，南京农业大学吕慧能等也经此途径获得再生植株。
1.2 大豆器官发生与植株再生
器官发生再生系统是指通过激素等因素诱导具有不定芽发生潜能的外植体位点使其再生植株的再生系统。Cheng等在20世纪80年代采用无菌的苗子叶节第一次成功的培育并获得了再生植株，随着科学技术的不断发展，随后就相继出现了一些大豆再生植株利用一些经器官所产生的相关报道。
1.3 植株再生以及大豆体细胞胚胎发生
在一定的条件下，双倍或者是单位体的体细胞没有经过性细胞的结合只通过与合子胚产生相似的途径发育出相似的合子胚的过程就叫做体细胞胚胎发生(称为体细胞胚或胚状体或体胚的形态发生过程)。体细胞胚可以进一步萌发形成新的个体，并发育为小植株。大豆的未成熟的子叶、未成熟胚胎以及下胚轴等是大豆体细胞胚胎发生常用的外植体。
2 大豆遗传转化的研究进展
2.1 农杆菌介导的大豆遗传转化
在我国农业经济迅速发展的今天，大豆遗体转化方式也分为花粉管通道法、电击法、农杆菌介导法、子房注射法、农杆菌介导和基因枪结合转化法、基因枪法、超声波辅助农杆菌介导法等等。在本文中，主要提到的是三种方法：第一是农杆菌介导法，第二是基因枪法，第三是花粉管通道法。植物遗传转化的农杆菌常采用包括土壤根癌农杆菌以及发根农杆菌。叶盘转化法与整体植株接种共感染法是构成农杆菌转化的主要方法。我们所说的叶盘转化法就是由Horsch等实验出来的一种转化方法，其具体的食用方法就是先用打孔器把消毒叶片上所获得的叶圆片叫做叶盘。在我国目前的应用当中，大豆农杆菌转化大部分是选取改良叶盘法外植体主要依靠子叶、子叶节与下胚轴等等。
2.2 基因枪法大豆遗传转化问题 在我国目前广为应用的转化方法就是基因枪转化法，它使用于一部分对于农杆菌不敏感的植物中。在这些不敏感的植物中包含许多单子叶植物与部分双子叶植物。
结果表明轰击不同的组织，轰击进入细胞层的深度也不同。Falco等用基因枪法获得一些游离赖氨酸增加几百倍的转基因大豆植株及高含量赖氨酸的种子。
2.3 大豆种质遗传转化系统
鉴于大豆离体再生以及遗传转化的高难度性，不经过离体组织培养的转化系统对解决大豆遗传转化面临的问题很有吸引力。通过我国植物科学家以及农业学家的不断试验与探究，共有两个重要的转化系统。其一就是通过花粉管通道方法来将高蛋白的野生大豆中总的DNA移入到大豆的栽培过程中，通过这样的过程来获得高产量高蛋白的大豆品种之一黑生。其二就是采用子房注射方式。刘博林等通过这种方法已经将atrazine抗性基因转入大豆叶绿体中并获得转化植株，岳绍先等将atrazine抗性基因的质粒逐步移入到大豆的受体中以此获取抗atrazineF123的转基因大豆。
3 大豆遗传转化问题以及前景展望
从成果上来看，大豆遗传转化技术已经取得了一定的成就，但是部分转基因大豆也已经商业化，但是总体来看，大豆的遗传转化在技术上远未成熟。具体到各种不同的转化方法，表现为：(1)建立在大豆器官发生再生体系基础上的大豆转化技术，虽然技术操作相对简单，但是嵌合体现象严重，筛选、纯化的难度大；(2)虽然大豆体细胞胚胎发生的再生体系被认为是解决大豆遗传转化中嵌合体问题的最具潜力的再生体系，但是目前面临农杆菌介导的转化不是很成功，以及长时间离体培养会造成体细胞变异等问题；(3)以大豆原生质体再生体系为基础的转化系统在理论上也有很大希望，并且逐渐改变大豆遗传转化的种种不良现象，然而我们所面临的现实问题就是系统进行的复杂性，掌握难度较大，工作任务较重，各种基因型所产生的差异巨大，再生的频率更加降低。(4)花粉管直接导入法是目前国内常用的方法之一，但是由于此方法的分子机理不是很清楚，因此在应用上还存在很大争议。总体来看，大豆和已经实现稳定遗传转化的植物一样，具有用来进行有效遗传转化的美好前景，但是目前还没有建立一种高效、稳定、快捷、简便的应用于大豆转化的再生体系，而现有的再生系统也不能与当前植物遗传转化方法很好的结合，这是限制大豆遗传转化技术发展的关键因素。同时研究转基因植株外源基因在植物体中的稳定表达和遗传，也是大豆遗传转化技术进一步发展道路上的一个重要命题。建立一个适合用于大豆遗传转化的有效再生受体系统，并在前人工作基础上对各种转化方法进行优化创新，摸索出一个高效的遗传转化新体系，才能实现规模化的大豆遗传转化，为改良大豆品质、提高大豆产量以及大豆功能基因组研究提供实质性的工具。
大豆遗传转化技术目前面临的另外一个生产方面的问题：生物安全性问题。近年来由于为转基因作物在发展市场的时候遇到了很多实质性的问题，尤其是欧洲国家的相关条例，非常反对使用转基因类的作物食品，这就为这些转基因作物寻找、进入市场带来了巨大的困难。这样的问题已经涉及到了生物安全性，我们一般从六个方面来看转基因作物的生物安全性，转移基因、杂草化、性状效应、遗传与表型的改变、病原遗传物质的表达和工作人员的人身安全。在这里面风险最大的就是杂草化了，这里面包括抗性作物本身的杂草化，抗性杂草的产生大部分原因要归结于抗性基因的飘移的副作用。同时也在整体环境的影响程度以及食品食用的安全问题，抗性基因所显露出的稳定因素，多种原因导致的抗性杂草的发生等等问题。我们也必须清醒的认识到，抗除草剂转基因作物的食品安全问题也有诸多不能预见的问题，在短暂的几年时间内不会做出特别肯定的答案，这是一项长期的工作，必须要靠长时间的监控才会取得精确的数据以及结果。从之前的试验中我们看出传统大豆的高温敏感性要低于转草甘膦大豆，再经历过遗传的填补之后仍然不能够取得高产量，也许会出现远远低于其他普通优良的品种产量。在动物食用草甘膦后会改变其自身体内的激素成分，从而破坏动物的生殖系统，究其原因，就在于草甘膦应用于豆科植物的时候会生成一种植物的雌激素，草甘膦的持续性很强，它会长期存在于土壤中，不溶解。这不仅危害了土壤中的动物，而且也会破坏以及污染地下水，并且进入恶性循环，从而导致破坏了土壤生化循环。除此之外，仅仅通过上述问题研究远远不能够就此得出转基因作物安全性的结论，我们还必须考虑到外源基因也是一个物种转移到另一物种过程中也会存在过敏的危险因素。
虽然大豆的遗传转化技术在前进的道路上面临种种问题，但是我们会利用现在已取得的成果来不断完善大豆的遗传转化技术。主要是在实验中不断应用大豆的离体再生体系，以及在应用过程中不断改善再生体系。其次是在研发与应用方面侧重大豆的转化体系，再次是通过进行识别与分离、克隆与使用新目标基因，以及整个基因大豆整个产业链的发展，在不久的将来，肯定会为我们生产出安全可靠地转基因类的大豆产品，以此来缓解人类在粮食产量以及产品质量问题以及环境污染问题等等。同时，我国大豆产业要与其他农作物一样，要加大生物科技的研发，创造出高效的、稳定的大豆遗传转化系统的安全大豆，我国应制定相应的标准与规范，实时监测，通过精确的数据统计，从而提升种植效益，不断加大我国大豆产业的核心竞争力。