论文部分内容阅读
背景:真菌DNA的提取在真菌基因工程以及分子生物学研究中占有重要地位。DNA的提取效率,尤其是DNA的质量严重影响实验结果。目的:建立提取病原真菌基因组DNA的方法,探讨简单重复序列-PCR反应体系中各成分的最佳组合。设计、时间及地点:DNA提取方法对照分析及正交实验,于2004-06/2006-12在吉林大学白求恩医学院病原生物学教研室真菌学研究室进行。材料:将接种临床标本的马铃薯葡萄糖液体培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基、酵母蛋白胨液体培养基28℃培养3～7d后,选取可疑菌落进行分离、纯化。方法:比较玻璃珠-盐析法、CTAB法、GeneTLETM抽提法3种不同DNA提取方法对菌体DNA质量的影响;利用正交设计,选择TaqDNA聚合酶、模板DNA、dNTP、引物4个因素,在3个水平上根据L9(34)正交表进行试验,对真菌简单重复序列-PCR(SSR-PCR)体系进行优化分析;并通过PCR选择适宜的退火温度及循环次数。主要观察指标:根据扩增获得带型的多态性和特异性,确定最佳反应体系。结果:GeneTLETM抽提法全部在相应的PCR体系中扩增出目的片段,且带型清楚度、明亮度优于其余两种方法。SSR-PCR反应体系正交试验结果显示,根据R值大小确定因素显著性顺序为模板DNA(2.67)>TaqDNA聚合酶(2.00)>dNTP(0.67)>引物(0.33);根据ki值大小确定各因素优化水平组合为:模板DNA30mg/L,TaqDNA聚合酶1U,dNTP150μmol/L,引物0.5μmol/L。但由于引物作为影响因素的R值小,是非显著因素,因此引物取A水平即0.25μmol/L。反应条件以53℃退火温度、35个循环次数为最佳。结论:GeneTLETM提取法提取DNA的效率更高、操作步骤快速简单。根据正交试验的优化结果,SSR-PCR最佳反应体系为模板DNA30mg/L,TaqDNA聚合酶1U,dNTP150μmol/L,引物0.25μmol/L。反应条件以53℃退火温度、35个循环次数为最佳。