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摘要：以银杏基因组数据为基础，对银杏bHLH转录因子进行筛选和分析，从银杏基因组中鉴定出72条bHLH转录因子。进一步分析发现，不同bHLH转录因子序列长度和分子量差异较大，而理论等电点及亲水性等比较接近;各家族成员均含有N端碱性氨基酸区和C端的螺旋环螺旋区;该家族可分为17个亚家族，相同亚家族成员保守基序的类型十分相似。通过启动子分析发现，多数银杏bHLH基因启动子均含有光响应元件、激素响应元件和逆境胁迫响应元件等。表达分析结果显示，有7条银杏bHLH基因的表达具有组织特异性，有6条基因在各组织中表达水平都比较高，预测其在银杏生物学过程中具有十分重要的作用。
关键词：银杏;bHLH转录因子;进化分析;表达分析
中图分类号：S792.95
文献标识码：A
文章编号：1000-4440（2019）02-0400-12
bHLH（Basic helix-loop-helix）转录因子是广泛存在于动、植物中的转录因子超家族，因其“碱性螺旋-环-螺旋”保守结构域而命名[1]。鸟类成髓细胞癌病毒中的c-MYC原癌基因是第1个被发现的bHLH家族成员基因[2]，之后该类型的基因又陆续在多种动、植物中被发现[3]。该家族蛋白质的bHLH保守结构域大约含有60个氨基酸，其碱性区域分布在多肽链的N端，并负责与特定DNA的顺时作用元件结合;HLH区域位于C末端，参与二聚体或者异二聚体的形成，从而行使其功能。
动物中bHLH家族数量较多，被分为A～F等6个组，共计45个家族[4]。与动物相比，植物中bHLH家族转录因子相对较少，而且大多数植物的bHLH蛋白在动物的该家族分类中属于B组[5]，根据植物中bHLH蛋白的序列同源性，又可将其分为不同的亚家族[5-6]。到目前为止，拟南芥中已鉴定的bHLH家族转录因子有162种，并且与水稻中的bHLH转录因子一起被分成了25个亚家族[7-9]。有学者对拟南芥、毛果杨、水稻、小立碗藓以及5种藻类的bHLH转录因子进行综合分析，并将其分成32个亚家族[10]。随着二代和三代测序技术的发展，苹果梨、樱桃、西瓜、甘薯、大白菜等越来越多植物的bHLH家族转录因子被鉴定出来[11-17]。
植物中bHLH家族不但数量较多，还参与植物生长发育、形态建成、逆境胁迫和次生代谢调控等多种生物学过程[18-19]。近年来，植物bHLH家族蛋白质的功能研究已经成为热点并且得到了快速发展。拟南芥作为模式植物，其bHLH转录因子功能研究相对较多。有研究者发现AtbHLH112对抗盐、抗旱和抗渗透胁迫有正调控作用，但是对拟南芥根系的发育有抑制作用[2021]。FIT转录因子可与At-bHLH38和AtbHLH39 共同调控拟南芥的铁代谢[2]。光敏色素作用因子PIF4，也是一个bHLH家族成员，对光敏色素B的信号转导有抑制作用[23]。另外，研究者在西瓜基因组中共计鉴定出96个bHLH转录因子，并预测其中多个bHLH转录因子可能在低温、ABA和盐胁迫中发挥重要作用[13]。还有研究者发现水稻中OsbHLHl基因可能与其抗低温胁迫相关[24]。
银杏是原产中国的特色经济树种，栽培历史悠久，用途广泛，经济价值高，拥有中华树木“国宝”之称[25]。植物中的bHLH家族研究在近年来得到了快速发展，但是到目前为止，在银杏中被筛选出的bHLH转录因子并不多，仅有1条被命名为bHLH91的转录因子被克隆并进行了表达分析[26-27]。本研究通过生物信息学方法，在全基因组范围内对银杏bHLH转录因子家族成员进行分离鉴定，并对鉴定出的银杏bHLH转录因子进行理化性质、系统进化、启动子结构和基因表达等方面进行分析，为bHLH转录因子功能的解析提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 银杏bHLH家族的筛选
以Pfam数据库中bHLH家族的保守域PF00010为参考序列，用HMMER 3.0软件在测试银杏基因组库（GigaDB，http：//gigadb.org/dataset/100209）中进行检索。检索得到的序列用NCBI-CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）和SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）在线程序进行保守域预测，去除假阳性序列[28]。将预测的具有bHLH保守域的序列作为银杏bHLH家族候选转录因子，用于后续分析。
1.2 银杏bHLH家族的理化性质及保守域和保守基序分析
bHLH家族候選蛋白质的氨基酸数、分子量、理论等电点等理化性质用在线软件ExPASy中的Prot-Param模块（https：//web.expasy.org/protparam/）进行分析。用DNAMAN（Lynnon Corporation，USA）对银杏bHLH家族候选基因编码的保守氨基酸序列进行多序列比对，并用MEME在线程序（http：//meme-suite.org/tols/meme）进行氨基酸的保守基序分析[29]。
1.3 银杏bHLH转录因子家族的进化分析
从PlantTFDB数据库（http：//planttfdb.cbi.pku.edu.cn/）中下载拟南芥bHLH转录因子序列作为参考，每个亚家族分别下载1～4条，共下载了49条At-bHLH家族转录因子[30]。将银杏候选bHLH蛋白序列与24个AtbHLH参考序列用MUSCLE法进行多序列比对，截取bHLH保守域序列并用软件MEGA5.0的Neighbo-Joining邻接法构建进化树，校验参数Bootstrap重复1000次[31]。
1.4 银杏bHLH转录因子家族基因结构分析
从银杏基因组数据库中提取筛选出bHLH基因CDS序列对应的基因组序列，用GSDS 2.0在线程序绘制基因外显子-内含子模式图。 1.5 银杏bHLH家族基因的启动子分析
从银杏基因组数据库中截取银杏bHLH家族基因成员起始密码子上游2000 bp序列作为启动子区，利用植物顺式作用元件数据库SOGO（https：//sogo.dna.affre.go.jp/cgi-bin/sogo.cgi？sid=
关键词：银杏;bHLH转录因子;进化分析;表达分析
中图分类号：S792.95
文献标识码：A
文章编号：1000-4440（2019）02-0400-12
bHLH（Basic helix-loop-helix）转录因子是广泛存在于动、植物中的转录因子超家族，因其“碱性螺旋-环-螺旋”保守结构域而命名[1]。鸟类成髓细胞癌病毒中的c-MYC原癌基因是第1个被发现的bHLH家族成员基因[2]，之后该类型的基因又陆续在多种动、植物中被发现[3]。该家族蛋白质的bHLH保守结构域大约含有60个氨基酸，其碱性区域分布在多肽链的N端，并负责与特定DNA的顺时作用元件结合;HLH区域位于C末端，参与二聚体或者异二聚体的形成，从而行使其功能。
动物中bHLH家族数量较多，被分为A～F等6个组，共计45个家族[4]。与动物相比，植物中bHLH家族转录因子相对较少，而且大多数植物的bHLH蛋白在动物的该家族分类中属于B组[5]，根据植物中bHLH蛋白的序列同源性，又可将其分为不同的亚家族[5-6]。到目前为止，拟南芥中已鉴定的bHLH家族转录因子有162种，并且与水稻中的bHLH转录因子一起被分成了25个亚家族[7-9]。有学者对拟南芥、毛果杨、水稻、小立碗藓以及5种藻类的bHLH转录因子进行综合分析，并将其分成32个亚家族[10]。随着二代和三代测序技术的发展，苹果梨、樱桃、西瓜、甘薯、大白菜等越来越多植物的bHLH家族转录因子被鉴定出来[11-17]。
植物中bHLH家族不但数量较多，还参与植物生长发育、形态建成、逆境胁迫和次生代谢调控等多种生物学过程[18-19]。近年来，植物bHLH家族蛋白质的功能研究已经成为热点并且得到了快速发展。拟南芥作为模式植物，其bHLH转录因子功能研究相对较多。有研究者发现AtbHLH112对抗盐、抗旱和抗渗透胁迫有正调控作用，但是对拟南芥根系的发育有抑制作用[2021]。FIT转录因子可与At-bHLH38和AtbHLH39 共同调控拟南芥的铁代谢[2]。光敏色素作用因子PIF4，也是一个bHLH家族成员，对光敏色素B的信号转导有抑制作用[23]。另外，研究者在西瓜基因组中共计鉴定出96个bHLH转录因子，并预测其中多个bHLH转录因子可能在低温、ABA和盐胁迫中发挥重要作用[13]。还有研究者发现水稻中OsbHLHl基因可能与其抗低温胁迫相关[24]。
银杏是原产中国的特色经济树种，栽培历史悠久，用途广泛，经济价值高，拥有中华树木“国宝”之称[25]。植物中的bHLH家族研究在近年来得到了快速发展，但是到目前为止，在银杏中被筛选出的bHLH转录因子并不多，仅有1条被命名为bHLH91的转录因子被克隆并进行了表达分析[26-27]。本研究通过生物信息学方法，在全基因组范围内对银杏bHLH转录因子家族成员进行分离鉴定，并对鉴定出的银杏bHLH转录因子进行理化性质、系统进化、启动子结构和基因表达等方面进行分析，为bHLH转录因子功能的解析提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 银杏bHLH家族的筛选
以Pfam数据库中bHLH家族的保守域PF00010为参考序列，用HMMER 3.0软件在测试银杏基因组库（GigaDB，http：//gigadb.org/dataset/100209）中进行检索。检索得到的序列用NCBI-CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）和SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）在线程序进行保守域预测，去除假阳性序列[28]。将预测的具有bHLH保守域的序列作为银杏bHLH家族候选转录因子，用于后续分析。
1.2 银杏bHLH家族的理化性质及保守域和保守基序分析
bHLH家族候選蛋白质的氨基酸数、分子量、理论等电点等理化性质用在线软件ExPASy中的Prot-Param模块（https：//web.expasy.org/protparam/）进行分析。用DNAMAN（Lynnon Corporation，USA）对银杏bHLH家族候选基因编码的保守氨基酸序列进行多序列比对，并用MEME在线程序（http：//meme-suite.org/tols/meme）进行氨基酸的保守基序分析[29]。
1.3 银杏bHLH转录因子家族的进化分析
从PlantTFDB数据库（http：//planttfdb.cbi.pku.edu.cn/）中下载拟南芥bHLH转录因子序列作为参考，每个亚家族分别下载1～4条，共下载了49条At-bHLH家族转录因子[30]。将银杏候选bHLH蛋白序列与24个AtbHLH参考序列用MUSCLE法进行多序列比对，截取bHLH保守域序列并用软件MEGA5.0的Neighbo-Joining邻接法构建进化树，校验参数Bootstrap重复1000次[31]。
1.4 银杏bHLH转录因子家族基因结构分析
从银杏基因组数据库中提取筛选出bHLH基因CDS序列对应的基因组序列，用GSDS 2.0在线程序绘制基因外显子-内含子模式图。 1.5 银杏bHLH家族基因的启动子分析
从银杏基因组数据库中截取银杏bHLH家族基因成员起始密码子上游2000 bp序列作为启动子区，利用植物顺式作用元件数据库SOGO（https：//sogo.dna.affre.go.jp/cgi-bin/sogo.cgi？sid=