【摘 要】
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目的构建人血小板第4因子（PF4）基因启动子-绿色荧光蛋白（GFP）报告基因载体PLVX-PF4-promoter-GFP,并检测其转录活性。方法在NCBI数据库中获得人PF4基因启动子5’端非编码区包含转录起始位点在内的-245～+49 bp的DNA序列。以正常人全血基因组DNA为模板,利用PCR扩增该序列,与GFP序列连接并插入到PLVX-tight-puro载体上,构建重组质粒PLVX-PF
【基金项目】
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国家重点研发计划（2017YFA0103100,03,04）； 国家自然科学基金（31801227,81872553）； 北京市自然科学基金(7194303；
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目的构建人血小板第4因子（PF4）基因启动子-绿色荧光蛋白（GFP）报告基因载体PLVX-PF4-promoter-GFP,并检测其转录活性。方法在NCBI数据库中获得人PF4基因启动子5’端非编码区包含转录起始位点在内的-245～+49 bp的DNA序列。以正常人全血基因组DNA为模板,利用PCR扩增该序列,与GFP序列连接并插入到PLVX-tight-puro载体上,构建重组质粒PLVX-PF4-promoter-GFP。将其包装慢病毒并感染MEG01细胞,用嘌呤霉素筛选出稳转细胞株,并用12-肉豆蔻酰-13-乙酸佛波酯（PMA）诱导MEG01细胞分化成熟,通过流式细胞术检测GFP表达率,从而验证报告基因的转录活性。结果构建的载体PLVX-PF4-promoter-GFP经酶切鉴定及测序结果比对完全正确,将其转入MEG01细胞,经药物筛选获得了MEG01-PF4-GFP细胞株。流式细胞术检测结果表明,正常培养条件下的MEG01-PF4-GFP细胞中GFP阳性细胞率低[（5.467±0.2603）%],该细胞经PMA诱导分化后,GFP阳性细胞率显著升高[（24.93±2.571）%]。结论成功构建了人PF4启动子-GFP报告基因载体,为后续深入研究PF4基因的调控机制及巨核细胞发育分化的分子生物学机制奠定了基础。
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