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【关键词】 乙型肝炎病毒；感染模型；转基因技术
文章编号：1003-1383(2008)02-0222-04中图分类号：R 512.62文献标识码：A
乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染具有明显的种属特异性，是目前知道的最小的嗜肝DNA病毒，在易感宿主细胞内易于附着、侵入和复制，并可长期持续感染。然而，HBV的易感宿主范围很狭窄，仅限于人、黑猩猩等灵长类动物，故很难在普通实验动物中建立疾病模型。因此，建立适合于HBV研究、简单易得的实验模型一直是研究者们追求的目标。在过去的20多年间，国内外学者陆续建立了多种相应的嗜肝DNA病毒模型，但尚无一个理想的模型可准确地代表人HBV感染的所有特征。自转基因技术出现以后，HBV转基因小鼠的研制使HBV研究取得了很大的发展。近年来，人鼠嵌合模型的研究成为热点。本文将从细胞模型和动物模型两方面对模型在HBV研究中的应用作系统综述。
HBV感染基因及原代培养的细胞模型
细胞模型目前研究的有人肝癌细胞和HBV感染原代培养的肝细胞两个模型。人肝癌细胞模型有三个不同的细胞系建株：
①PLC/PRF/5细胞系，由人肝癌细胞建株，具有不产生清蛋白，不含HBV DNA的游离分子（所有HBV DNA分子均整合到细胞DNA中），只表达少量HBsAg，不产生抗壳抗原和Dane颗粒等特点，故此细胞系主要用于研究感染HBV后，相关细胞因子对肝脏细胞的生物学效应，如抑制因子对肝细胞的作用［1］；也可用于一些抗病毒药物的研究，如反义寡核苷酸等对HBsAg的抑制作用［2］。
②HepG2细胞系，是由肝胚瘤细胞的活体组织建株，通过转染HBV全基因到肝癌细胞，具有肝细胞所特有的绝大部分功能，可分泌多种血浆蛋白和表达HBsAg和HBeAg，主要用于HBV DNA结构与功能、HBV对肝细胞的作用、抗病毒药物与HBV感染的关系等研究［3］。
③HepG2.2.15细胞系，则是应用重组载体pDOLTHBV1转染HepG2细胞，可获得稳定分泌病毒蛋白和病毒颗粒的细胞克隆，这个细胞系能稳定分泌大量的HBsAg、HBeAg和Dane颗粒，细胞内可检到HBV DNA和RNA，但无cccDNA。细胞中不同部分整合的分子，含有头－尾连接的拷贝，也含有cDNA和单链DNA，因此，HepG2.2.15细胞系成为应用最广泛的乙型肝炎细胞模型［4］。此外，HepG2.2.15细胞系可持续长时间地维持病毒复制，经多代培养仍保持病毒复制，病毒复制水平较低，但因其可分泌HBsAg、HBeAg、HBV DNA和完整的病毒颗粒，故还可用于抗HBV感染基因治疗的研究［5］。尽管如此，HepG2.2.15细胞系仍然存在以下问题，致使其应用受到一定限制，即HBV是整合在宿主细胞染色体上，复制方式与自然感染不同，且不能被清除；病毒复制的水平不能人为改变；病毒复制水平较低；细胞培养中不产生cccDNA。
而HBV感染原代培养的肝细胞模型是在原代正常人肝细胞培养中加入含HBV颗粒的血清或在正常鸭肝细胞培养中加入DHBV，均可构建HBV感染的原代培养肝细胞模型。Springzl等［6］利用AdHBV 1.3分别感染人原代肝细胞、小鼠肝细胞、大鼠肝细胞、树鼩肝细胞、鸭肝细胞和HepG2细胞，应用southern、northern、westernblot等方法评价。发现该细胞系与HepG2.2.15细胞系相比，具有高效转移、表达cccDNA，可对HBV突变和表达进行人为调控等优点，故主要用于研究HBV对正常人肝细胞附着、HBV病毒早期感染过程、DHBV外膜蛋白抗体的抗感染作用以及抗病毒药物筛选等。但是，DHBV与HHBV的基因结构存在差异，其结果的应用受到一定限制。
建立感染HBV动物模型的研究现状
黑猩猩是HBV研究最具有代表性的动物模型，因为在所有动物中，灵长类与人类具有最近的亲缘关系，而黑猩猩与人类的亲缘关系最接近。受HBV感染的黑猩猩绝大部分出现典型急性乙肝症状，细胞免疫反应与人类相似，因此可用于进行急性乙型肝炎机体免疫和肝脏病理方面的研究；少部分形成慢性感染，又可用来研究HBV持续感染的机制。但由于黑猩猩属濒危动物、来源困难、价格昂贵，且不易诱发重症与癌变，应用受到限制。
产于我国云南、广西一带的低等小型灵长类动物树鼩，在生理机能、生化代谢和基因组成等方面与人类具有相似性，是目前已知除黑猩猩外唯一能感染人HBV的动物品系，而且树鼩比较能适应实验环境，因此，树鼩有望成为HBV感染的实验小动物模型。有资料报道用人HBV接种树鼩发现肝脏细胞内有HBV DNA复制，血清ALT明显升高。可见树鼩可用于研究HBV感染机制、抗HBV药物筛选、乙肝疫苗安全性和免疫效果评价等。然而，树鼩目前多以野生繁殖为主，捕获后短期饲养便进行实验，实验结果稳定性较差。此外，树鼩感染人HBV后转为慢性感染的成功率尚待提高［7］。目前研究发现一些禽类和哺乳类动物都可感染HBV。因此建立嗜肝DNA病毒动物模型倍受重视。目前研究较多的是鸭乙型肝炎病毒（DHBV）是禽类嗜肝DNA病毒，其核酸组成与人HBV仅有40%~70%同源性，无X开放读码框，膜蛋白基因只编码非糖基化的大、小蛋白，无中蛋白。鸭子是DHBV的自然宿主，其自然感染方式主要为垂直传播，因此，先天性或幼年感染的雏鸭可发展为持续性DHBV感染。国内各地采用当地成熟或雏鸭建立模型，如广州麻鸭、北京麻鸭等。尽管DHBV进入鸭肝细胞的分子机制可能与人不尽相同，但是通过对DHBV模型的研究，在一定程度上阐述了乙肝病毒的复制机制和共价闭合环状DNA（cccDNA）的作用。DHBV模型也可用来评价临床前期抗病毒药物，如核苷类似物、反义寡核苷酸等治疗效果［8］。虽然鸭感染DHBV的具体特征与人类感染HBV有一定差异，但是鸭易于孵育饲养、经济、易得，并能建立病毒持续感染和提供一个与HBV相似的体内实验系统，因此，鸭乙型肝炎病毒模型被广泛应用。土拨鼠肝炎病毒（WHV）是哺乳类嗜肝DNA病毒，与人HBV基因组DNA序列同源性高于DHBV，约为70%以上，且基因组结构也相似。慢性感染WHV的土拨鼠可发展为重症肝炎和肝癌，其表现明显类似于人类感染HBV，且仅在肝、脾中发现有WHV DNA复制中间体和WHV RNA，故土拨鼠适用于研究HBV慢性感染的发病机制和抗乙肝病毒药物研究［9］。但土拨鼠来源困难，我国西北地区自然存在与土拨鼠同种同属的“旱獭”，可用于构建HBV感染的动物模型。张珺等［10］的研究结果显示，新疆灰旱獭肝组织中嗜肝病毒表面抗原检出率达82.2%，提示可以利用我国丰富的旱獭资源建立HBV感染的动物模型方面研究。然而，WHV与HBV在分类、结构和生物学功能等方面不完全相同，故WHV动物模型在研究HBV感染机理及复制过程中的应用受到一定限制。
复制转染HBV小鼠模型的临床意义
Chisari等使用显微注射法首次建立了HBV转基因小鼠模型，目前该模型可分为HBV部分序列、全基因序列和超长序列转基因鼠模型。HBV部分序列转基因小鼠模型只表达单一基因产物，不能产生病毒，因此不适宜用于病毒复制的研究。而屠亚军等［11］所建立的人HBVx基因转基因小鼠模型，可用于研究慢性乙型肝炎患者诱发肝癌的机制及HBX的反式激活机制。HBV全基因或超长序列转基因小鼠具有病毒DNA复制及蛋白质合成的能力，能产生较高水平的血清HBsAg及HBeAg，血清中可检出HBV DNA，认为该类模型可用于评价抗病毒药物的疗效。作为一种新策略，siRNA显示了潜在的良好的治疗效果，它通过降解与目的基因相似的双链RNA可致靶基因沉默，针对HBV的siRNA可通过重组腺病毒载体有效地进入转基因小鼠的肝脏，完全抑制转基因鼠中HBV达4周之久，显示了siRNA的治疗效果［12］。宿主对HBV感染产生免疫耐受，但不引发体内的免疫清除，这是HBV感染后形成慢性化的主要机制之一。因转基因小鼠对HBV抗原处于免疫耐受状态，还可用于研究感染慢性化的形成机理。熊一力等［13］在研究树突状细胞的抗原提呈功能时，发现转基因小鼠对HBV的抗原提呈能力低下，同时观察到小鼠的T淋巴细胞免疫活化受到抑制，鼠肝细胞应答能力下降，由此推测树突状细胞的抗原提呈能力下降，是宿主对HBV产生免疫耐受的关键。此外，转基因小鼠还可用于慢性HBV携带者的免疫反应缺陷机理、HBV持续感染中抗原提呈细胞作用规律等方面的研究。
尽管HBV转基因小鼠模型在研究HBV感染时显示了非常好的优势，但仍存在一些缺陷：①HBV转基因小鼠的HBV DNA虽完全整合到小鼠基因组上，但与HBV自然感染人体的状态有所不同；②转基因小鼠具有遗传不稳定性；③鼠肝内缺乏cccDNA病毒转录模板的形成，进入鼠肝细胞内的HBV复制时不具有完整的生活周期，不能完全模拟出病毒在人体内的复制过程；④操作复杂、整体费用高；⑤转基因鼠的免疫耐受状态跟人体感染HBV后的免疫反应过程存在一定差异。
研究认为，表达特定基因的转基因鼠可用来研究某些特定基因表达产物对HBV的影响和潜在的致癌性。资料显示在S基因过度表达的转基因小鼠中，HBsAg大量产生，堆积在肝细胞的内质网，对肝脏产生毒性，引起慢性肝损伤、炎症、增生及转录失控，严重的可引起染色体缺失，出现肝癌［14］。为了探索X蛋白在肝癌形成中的潜在作用，制备HBVx或WHVx基因的转基因鼠，使X蛋白过度表达，结果证明X蛋白在体内可以促进病毒的复制，显著提高病毒蛋白的表达，并且肝脏内X蛋白表达程度跟肝癌产生存在相关性，这可能是X蛋白能削弱p53的功能所致［15］。
为了克服鼠类对HBV不易感的缺陷，研究者构建了重组腺病毒和杆状病毒载体，携带具有复制能力的HBV基因，转染培养的细胞系或原代肝细胞及给小鼠尾静脉注射，在肝细胞内出现HBV复制，并检出cccDNA，结果显示腺病毒携带外源基因进入肝脏的效率高于杆状病毒，且容易被补体系统灭活，因此，认为杆状病毒不适合用于体基因转移的研究。重组腺病毒载体与HBV 1.3构建的AdHBV 1.3体系静脉注射小鼠后，在鼠肝细胞内检出HBV的复制，但是由于机体的免疫系统作用，致使HBV不能长期感染，因此，腺病毒载体构建的病毒感染模型应用受到一定限制［16］。
采取流体动力学注射法在小鼠尾静脉一次性快速高容量（1.6ml/20g小鼠）注射质料，可以提高HBV基因的转染率。资料显示，应用流体动力学法同时注射表达HBV的质料和针对HBV的siRNA能够抑制病毒的复制［17］。认为流体动力学法注射导致HBV感染的模型可以用作研究抗病毒策略。与转基因小鼠相比，该模型有两个优点：①该模型既可用于急性HBV感染时机体免疫应答的研究，也可用于抗病毒药物及机体自发清除病毒的机制研究；②该模型还可用研究某些变异的病毒或人工突变的病毒在体内的复制能力。
探索嵌合体HBV复制治疗的新途径
要研究病毒早期感染阶段的机制、cccDNA的功能、病毒的细胞间扩散感染及病毒清除，就需要能够支持HBV感染以及复制的种属特异性肝细胞，由于体外培养的肝细胞内进行研究HBV不能完全模拟体内复制并具有其他缺陷等。最近研究报道了一些新的模型，将已感染或未感染HBV的人肝细胞移植到小鼠体内，作为研究HBV感染的良好体内模型。目前研究的主要有三种模型，
①三合体小鼠模型：HBV三合体小鼠（trimera mouse）是由Tlan等［18］首次建立的，即通过将感染有HBV的人肝脏组织片移植到Balb/c（已经SCID小鼠骨髓细胞重构免疫系统）小鼠，约有80%的小鼠出现病毒血症。血清中的病毒滴度比较低，维持时间仅20天，但短期观察抗病毒的疗效还是可行的。Trimera系统为研究HBV的复制、治疗提供了新途径。只是该模型中植入的人肝细胞只能在有限的时间内发挥作用，致使其不能长期研究。
②移植人肝细胞的免疫缺陷鼠模型：为了使植入的人肝细胞在鼠体内存活时间延长，人们探索将人肝细胞植入到免疫缺陷的小鼠肝脏构建模型。资料显示［19］，在缺失RAG2的小鼠肝脏内注射含HBV基因的永生化肝细胞，可长时间产生HBV，鼠内病毒滴度持续5个月之久。蒋黎等［20］报道在孕鼠子宫内注射人胎肝细胞，诱导胎鼠对人肝细胞产生免疫耐受，胎鼠出生后24 h内给新生小鼠脾脏内注射人胎肝细胞，1周后接种含人HBV的血清，建立针对人胎肝细胞耐受的人鼠嵌合肝动物模型，结果在鼠肝组织中能检测到CK18、HBsAg的表达。
③uPA转基因小鼠模型：uPA即尿激酶纤维蛋白溶酶原激活物。uPA转基因鼠因其肝细胞能特异表达AlbuPA转基因，诱导携带有该基因的肝细胞凋亡，引起肝细胞特异性损伤，从而利于移植细胞在该肝脏中的长期存活。Dandri等［21］将uPA转基因鼠跟RAG2基因缺陷鼠杂交，后代被植入旱獭肝细胞，由于RAG2基因缺陷鼠不能表达RAG2，故T、B淋巴细胞不能成熟，不具备完整的免疫功能，对外源肝细胞不排斥。因此，植入的肝细胞不断生长几乎取代整个鼠肝脏，且鼠内存在旱獭病毒的感染及复制。有报道［22］称人肝细胞植入2~3周龄的UPA/RAG2鼠内，在鼠肝中观察到人肝细胞特有因子表达及人肝细胞和鼠肝实质间出现胆管沟通。另有实验报道，给纯合子SCIDUPA杂交鼠植入人原代肝细胞后可以形成几乎完全的人肝细胞化的鼠肝脏。给该模型接种含HBV血清可长达5个月之久观察到高滴度的HBV［23］。该嵌合体作为研究HBV体内感染的小鼠模型，可反映HBV自然感染的全过程，优于黑猩猩及其他动物模型，但不适合用于研究HBV发病机制。
目前用于乙型肝炎相关研究的模型主要存在的问题是未能建立起在生物学分类上与人类相近，并具有感染率高，感染持续时间长，感染后肝组织或肝细胞的病理改变类似人乙型肝炎以及经济适用的研究模型。据以上所述，黑猩猩、树鼩等灵长类动物跟人类亲缘关系相近，更适合用于研究HBV感染，但这类动物珍贵难得而应用受到限制。应用较多的还是鸭、转基因鼠和HBV细胞模型，土拨鼠模型则在国外应用较多。但无论是非人类灵长类动物模型，还是简单易得的其他模型，作为有实验价值的HBV感染模型，必须具备2个条件：一是要有高水平的HBV基因表达及复制；二是要伴有持续性病毒复制和基因表达的慢性HBV感染。总之，建立对人HBV易感，且具有与人感染HBV后相同或相似的肝脏病理改变及疾病转归研究模型，将能促进人类攻克乙型肝炎的进程。
参考文献
［1］Feleszko W, Mlynarczuk I, Oslzewska D, et al. Lovastatin potentiates antitumor activity of doxorubicin in murine melanoma via an apoptosis-dependent mechanism［J］. Int J Cancer, 2002, 100: 111-118.
［2］尤向辉，任 军，李 锋，等. RNAi载体构建及其对PLC/PRF/5细胞突变p53基因抑制作用的实验研究［J］. 现代肿瘤医学，2005，13（2）：161-164.
［3］刘志英，黄玉波，魏红山，等.表达HBeAg和HBsAg对HepG2细胞系细胞因子分泌及ACE活性的影响［J］.世界华人消化杂志 2006，14(9):904-907.
［4］闵 军，陈积圣，刘彦文，等.转乙型肝炎病毒X基因肝癌细胞株的建立［J］.中华实验外科学杂志，2000，17：231-232.
［5］ 唐 盈，王燕菲.针对HBVS基因的反义锁核酸抗乙肝病毒表达的初探［J］.江西医学,2006，41（4）：205-208.
［6］Sprinzl MF,Oberwinker H,Schaller H,et al.Transfer of hepatitis B virus genome by adenovirus vectors into cultured cells and mice:crossing the species barrier［J］.J virol,2001,75:5108-5118.
［7］王树声，苏建家，冯百芳，等.树鼩、熊猴感染人乙型肝炎病毒肝细胞内感染指征的应用［J］.中华实验和临床病毒学杂志，2003，17（3）：244-246.
［8］王文逸，黄宇闻，陆 萍，等.利用鸭乙型肝炎病毒感染模型评价血液成分中病毒的灭活效果［J］.微生物与感染，2006，1（1）：21-24.
［9］Cote PJ,Korbs BE,Miller RH,et al.Effects of age and viral determinants on chronicity as an outcome of experimental woodchunk hepatitis virus infection［J］.Heacology,2000,31(1):190-200.
［10］张 珺，王宝菊，孟忠吉，等.旱獭肝组织中嗜肝病毒表面抗原表达的免疫组化研究［J］.华中医学杂志，2003，27（5）：231-232.
［11］屠亚军，祖 和，杨 鹏，等.人乙型肝炎病毒X基因转基因小鼠模型的建立［J］.中国医学科学院学报，2006，22（3）：263-265.
［12］Uprichard SL,Boyd B,Althage A,et al.Clearance of hepatitis B virus from the liver of transgenic mice by short hairpin RNAs［J］.Proc Natl Acad sci USA,2005,102:773-778.
［13］能一力，刘光泽，贾彦征.HBV转基因小鼠免疫耐受机制的实验研究［J］.世界华人消化杂志，2002，10（6）：642-645.
［14］Dunsford HA,Sell S,Chisari FV,et al.Altered expression of hepatic carcinogen metabolizing enzymes with liver injury in HBV transgenic mouse lineages expressing various amounts of hepatitis B surface antigen［J］.Liver,1999,19(2):81-87.
［15］Xu E,Yen TS,Wul,et al.Enhancement of hepatitis B virus replication by its X protein in transgenic mice［J］.J virol,2002,76(5):2579-84.
［16］Sprinzl MF,Oberwinkler H,Schaller H,et al.Transfer of hepatitis B virus genome by adenovirus vectors into cultured cells and mice:crossing the species barrie［J］.J virol,2001,75(11):5108-5118.
［17］Klein C,Bock CT,Wedemeyer H,et al.Inhibition of hepatitis B virus replication in vivo by nucleoside analogues and siRNA［J］.Gastroenterology,2003,125:9-18.
［18］Tlan E,Burakova T,Dagan S,et al.The hepatitis B virus trimera mouse:a model for human HBV infection and evaluation of anti-HBV therapeutic ageuts［J］.Hepatology,1999,29(2):553-562.
［19］Brown JJ,Parashar B,Moshage H,et al.A long-term hepatitis B viremia model generated by transplanting nontumrigenic immortalized human hepatocytes in Rag2deficient mice［J］.Hepatology,2000,31:173-181.
［20］蒋 黎，毛 青，王宇明，等.HBV感染的鼠嵌合肝动物模型的建立［J］.第三军医大学学报，2003，25（5）：5.
［21］Petersen J,Dandri M,Gupta S,et al.Liver repopulation with xenogenic hepatocyes in B and T cell deficient mice leads to chronic hepadmarirus infection and clonal growth of hepatocellular carcinoma［J］.Proc Natl Acad Sci USA,1998,95:310-315.
［22］Dandri M,Burda MR,Torok E,et al.Repupolation of mouse liver with human hepatacytes and in vivo infection with hepatitis B virus［J］.Hepatology,2001,33:981-988.
［23］Tsuge M,Hiraga N,Tataishi H,et al.Infection of human hepatocyte chimeric mouse with genetically engineered hepatitis B virus［J］.Hepatology,2005,42:1046-1054.
［24］kayo R,Kajita I,Cho s,et al.A study on insertion of a nasogastric tube in intubated patients［J］.Masui,2005,54(9):1034-1036.
［25］karagama YG,Lancaster JL,Karkanevatos A.Nasogastric tube insertion using flexible fibreoptic nasoendoscope［J］.Hosp med,2001,62(6):336-337.
［26］王华珍，卢月珍，唐良春. 机械通气患者肠内营养与肠外营养支持对撤机时间的影响［J］.中华护理杂志，2003，38（5）：325.
［27］王曙红，刘晶成，周建辉. 手势对机械通气患者身心感受的影响［J］.中华护理杂志，2003，38（5）：394.
［28］潘 瑛，王 妍，李雪枚.1例高龄“Ⅱ型呼吸衰竭”并发DIC的护理［J］.中国实用护理杂志，2006，22（11）：65.
［29］赵禾欣，姚 莉，李红英，等.慢性阻塞性肺疾病患者行机械通气期间肢体功能锻炼的研究［J］.中华护理杂志，2003，38（8）：626.
(收稿日期：2007-09-17 修回日期：2008-04-03)
(编辑：崔群飞)
文章编号：1003-1383(2008)02-0222-04中图分类号：R 512.62文献标识码：A
乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染具有明显的种属特异性，是目前知道的最小的嗜肝DNA病毒，在易感宿主细胞内易于附着、侵入和复制，并可长期持续感染。然而，HBV的易感宿主范围很狭窄，仅限于人、黑猩猩等灵长类动物，故很难在普通实验动物中建立疾病模型。因此，建立适合于HBV研究、简单易得的实验模型一直是研究者们追求的目标。在过去的20多年间，国内外学者陆续建立了多种相应的嗜肝DNA病毒模型，但尚无一个理想的模型可准确地代表人HBV感染的所有特征。自转基因技术出现以后，HBV转基因小鼠的研制使HBV研究取得了很大的发展。近年来，人鼠嵌合模型的研究成为热点。本文将从细胞模型和动物模型两方面对模型在HBV研究中的应用作系统综述。
HBV感染基因及原代培养的细胞模型
细胞模型目前研究的有人肝癌细胞和HBV感染原代培养的肝细胞两个模型。人肝癌细胞模型有三个不同的细胞系建株：
①PLC/PRF/5细胞系，由人肝癌细胞建株，具有不产生清蛋白，不含HBV DNA的游离分子（所有HBV DNA分子均整合到细胞DNA中），只表达少量HBsAg，不产生抗壳抗原和Dane颗粒等特点，故此细胞系主要用于研究感染HBV后，相关细胞因子对肝脏细胞的生物学效应，如抑制因子对肝细胞的作用［1］；也可用于一些抗病毒药物的研究，如反义寡核苷酸等对HBsAg的抑制作用［2］。
②HepG2细胞系，是由肝胚瘤细胞的活体组织建株，通过转染HBV全基因到肝癌细胞，具有肝细胞所特有的绝大部分功能，可分泌多种血浆蛋白和表达HBsAg和HBeAg，主要用于HBV DNA结构与功能、HBV对肝细胞的作用、抗病毒药物与HBV感染的关系等研究［3］。
③HepG2.2.15细胞系，则是应用重组载体pDOLTHBV1转染HepG2细胞，可获得稳定分泌病毒蛋白和病毒颗粒的细胞克隆，这个细胞系能稳定分泌大量的HBsAg、HBeAg和Dane颗粒，细胞内可检到HBV DNA和RNA，但无cccDNA。细胞中不同部分整合的分子，含有头－尾连接的拷贝，也含有cDNA和单链DNA，因此，HepG2.2.15细胞系成为应用最广泛的乙型肝炎细胞模型［4］。此外，HepG2.2.15细胞系可持续长时间地维持病毒复制，经多代培养仍保持病毒复制，病毒复制水平较低，但因其可分泌HBsAg、HBeAg、HBV DNA和完整的病毒颗粒，故还可用于抗HBV感染基因治疗的研究［5］。尽管如此，HepG2.2.15细胞系仍然存在以下问题，致使其应用受到一定限制，即HBV是整合在宿主细胞染色体上，复制方式与自然感染不同，且不能被清除；病毒复制的水平不能人为改变；病毒复制水平较低；细胞培养中不产生cccDNA。
而HBV感染原代培养的肝细胞模型是在原代正常人肝细胞培养中加入含HBV颗粒的血清或在正常鸭肝细胞培养中加入DHBV，均可构建HBV感染的原代培养肝细胞模型。Springzl等［6］利用AdHBV 1.3分别感染人原代肝细胞、小鼠肝细胞、大鼠肝细胞、树鼩肝细胞、鸭肝细胞和HepG2细胞，应用southern、northern、westernblot等方法评价。发现该细胞系与HepG2.2.15细胞系相比，具有高效转移、表达cccDNA，可对HBV突变和表达进行人为调控等优点，故主要用于研究HBV对正常人肝细胞附着、HBV病毒早期感染过程、DHBV外膜蛋白抗体的抗感染作用以及抗病毒药物筛选等。但是，DHBV与HHBV的基因结构存在差异，其结果的应用受到一定限制。
建立感染HBV动物模型的研究现状
黑猩猩是HBV研究最具有代表性的动物模型，因为在所有动物中，灵长类与人类具有最近的亲缘关系，而黑猩猩与人类的亲缘关系最接近。受HBV感染的黑猩猩绝大部分出现典型急性乙肝症状，细胞免疫反应与人类相似，因此可用于进行急性乙型肝炎机体免疫和肝脏病理方面的研究；少部分形成慢性感染，又可用来研究HBV持续感染的机制。但由于黑猩猩属濒危动物、来源困难、价格昂贵，且不易诱发重症与癌变，应用受到限制。
产于我国云南、广西一带的低等小型灵长类动物树鼩，在生理机能、生化代谢和基因组成等方面与人类具有相似性，是目前已知除黑猩猩外唯一能感染人HBV的动物品系，而且树鼩比较能适应实验环境，因此，树鼩有望成为HBV感染的实验小动物模型。有资料报道用人HBV接种树鼩发现肝脏细胞内有HBV DNA复制，血清ALT明显升高。可见树鼩可用于研究HBV感染机制、抗HBV药物筛选、乙肝疫苗安全性和免疫效果评价等。然而，树鼩目前多以野生繁殖为主，捕获后短期饲养便进行实验，实验结果稳定性较差。此外，树鼩感染人HBV后转为慢性感染的成功率尚待提高［7］。目前研究发现一些禽类和哺乳类动物都可感染HBV。因此建立嗜肝DNA病毒动物模型倍受重视。目前研究较多的是鸭乙型肝炎病毒（DHBV）是禽类嗜肝DNA病毒，其核酸组成与人HBV仅有40%~70%同源性，无X开放读码框，膜蛋白基因只编码非糖基化的大、小蛋白，无中蛋白。鸭子是DHBV的自然宿主，其自然感染方式主要为垂直传播，因此，先天性或幼年感染的雏鸭可发展为持续性DHBV感染。国内各地采用当地成熟或雏鸭建立模型，如广州麻鸭、北京麻鸭等。尽管DHBV进入鸭肝细胞的分子机制可能与人不尽相同，但是通过对DHBV模型的研究，在一定程度上阐述了乙肝病毒的复制机制和共价闭合环状DNA（cccDNA）的作用。DHBV模型也可用来评价临床前期抗病毒药物，如核苷类似物、反义寡核苷酸等治疗效果［8］。虽然鸭感染DHBV的具体特征与人类感染HBV有一定差异，但是鸭易于孵育饲养、经济、易得，并能建立病毒持续感染和提供一个与HBV相似的体内实验系统，因此，鸭乙型肝炎病毒模型被广泛应用。土拨鼠肝炎病毒（WHV）是哺乳类嗜肝DNA病毒，与人HBV基因组DNA序列同源性高于DHBV，约为70%以上，且基因组结构也相似。慢性感染WHV的土拨鼠可发展为重症肝炎和肝癌，其表现明显类似于人类感染HBV，且仅在肝、脾中发现有WHV DNA复制中间体和WHV RNA，故土拨鼠适用于研究HBV慢性感染的发病机制和抗乙肝病毒药物研究［9］。但土拨鼠来源困难，我国西北地区自然存在与土拨鼠同种同属的“旱獭”，可用于构建HBV感染的动物模型。张珺等［10］的研究结果显示，新疆灰旱獭肝组织中嗜肝病毒表面抗原检出率达82.2%，提示可以利用我国丰富的旱獭资源建立HBV感染的动物模型方面研究。然而，WHV与HBV在分类、结构和生物学功能等方面不完全相同，故WHV动物模型在研究HBV感染机理及复制过程中的应用受到一定限制。
复制转染HBV小鼠模型的临床意义
Chisari等使用显微注射法首次建立了HBV转基因小鼠模型，目前该模型可分为HBV部分序列、全基因序列和超长序列转基因鼠模型。HBV部分序列转基因小鼠模型只表达单一基因产物，不能产生病毒，因此不适宜用于病毒复制的研究。而屠亚军等［11］所建立的人HBVx基因转基因小鼠模型，可用于研究慢性乙型肝炎患者诱发肝癌的机制及HBX的反式激活机制。HBV全基因或超长序列转基因小鼠具有病毒DNA复制及蛋白质合成的能力，能产生较高水平的血清HBsAg及HBeAg，血清中可检出HBV DNA，认为该类模型可用于评价抗病毒药物的疗效。作为一种新策略，siRNA显示了潜在的良好的治疗效果，它通过降解与目的基因相似的双链RNA可致靶基因沉默，针对HBV的siRNA可通过重组腺病毒载体有效地进入转基因小鼠的肝脏，完全抑制转基因鼠中HBV达4周之久，显示了siRNA的治疗效果［12］。宿主对HBV感染产生免疫耐受，但不引发体内的免疫清除，这是HBV感染后形成慢性化的主要机制之一。因转基因小鼠对HBV抗原处于免疫耐受状态，还可用于研究感染慢性化的形成机理。熊一力等［13］在研究树突状细胞的抗原提呈功能时，发现转基因小鼠对HBV的抗原提呈能力低下，同时观察到小鼠的T淋巴细胞免疫活化受到抑制，鼠肝细胞应答能力下降，由此推测树突状细胞的抗原提呈能力下降，是宿主对HBV产生免疫耐受的关键。此外，转基因小鼠还可用于慢性HBV携带者的免疫反应缺陷机理、HBV持续感染中抗原提呈细胞作用规律等方面的研究。
尽管HBV转基因小鼠模型在研究HBV感染时显示了非常好的优势，但仍存在一些缺陷：①HBV转基因小鼠的HBV DNA虽完全整合到小鼠基因组上，但与HBV自然感染人体的状态有所不同；②转基因小鼠具有遗传不稳定性；③鼠肝内缺乏cccDNA病毒转录模板的形成，进入鼠肝细胞内的HBV复制时不具有完整的生活周期，不能完全模拟出病毒在人体内的复制过程；④操作复杂、整体费用高；⑤转基因鼠的免疫耐受状态跟人体感染HBV后的免疫反应过程存在一定差异。
研究认为，表达特定基因的转基因鼠可用来研究某些特定基因表达产物对HBV的影响和潜在的致癌性。资料显示在S基因过度表达的转基因小鼠中，HBsAg大量产生，堆积在肝细胞的内质网，对肝脏产生毒性，引起慢性肝损伤、炎症、增生及转录失控，严重的可引起染色体缺失，出现肝癌［14］。为了探索X蛋白在肝癌形成中的潜在作用，制备HBVx或WHVx基因的转基因鼠，使X蛋白过度表达，结果证明X蛋白在体内可以促进病毒的复制，显著提高病毒蛋白的表达，并且肝脏内X蛋白表达程度跟肝癌产生存在相关性，这可能是X蛋白能削弱p53的功能所致［15］。
为了克服鼠类对HBV不易感的缺陷，研究者构建了重组腺病毒和杆状病毒载体，携带具有复制能力的HBV基因，转染培养的细胞系或原代肝细胞及给小鼠尾静脉注射，在肝细胞内出现HBV复制，并检出cccDNA，结果显示腺病毒携带外源基因进入肝脏的效率高于杆状病毒，且容易被补体系统灭活，因此，认为杆状病毒不适合用于体基因转移的研究。重组腺病毒载体与HBV 1.3构建的AdHBV 1.3体系静脉注射小鼠后，在鼠肝细胞内检出HBV的复制，但是由于机体的免疫系统作用，致使HBV不能长期感染，因此，腺病毒载体构建的病毒感染模型应用受到一定限制［16］。
采取流体动力学注射法在小鼠尾静脉一次性快速高容量（1.6ml/20g小鼠）注射质料，可以提高HBV基因的转染率。资料显示，应用流体动力学法同时注射表达HBV的质料和针对HBV的siRNA能够抑制病毒的复制［17］。认为流体动力学法注射导致HBV感染的模型可以用作研究抗病毒策略。与转基因小鼠相比，该模型有两个优点：①该模型既可用于急性HBV感染时机体免疫应答的研究，也可用于抗病毒药物及机体自发清除病毒的机制研究；②该模型还可用研究某些变异的病毒或人工突变的病毒在体内的复制能力。
探索嵌合体HBV复制治疗的新途径
要研究病毒早期感染阶段的机制、cccDNA的功能、病毒的细胞间扩散感染及病毒清除，就需要能够支持HBV感染以及复制的种属特异性肝细胞，由于体外培养的肝细胞内进行研究HBV不能完全模拟体内复制并具有其他缺陷等。最近研究报道了一些新的模型，将已感染或未感染HBV的人肝细胞移植到小鼠体内，作为研究HBV感染的良好体内模型。目前研究的主要有三种模型，
①三合体小鼠模型：HBV三合体小鼠（trimera mouse）是由Tlan等［18］首次建立的，即通过将感染有HBV的人肝脏组织片移植到Balb/c（已经SCID小鼠骨髓细胞重构免疫系统）小鼠，约有80%的小鼠出现病毒血症。血清中的病毒滴度比较低，维持时间仅20天，但短期观察抗病毒的疗效还是可行的。Trimera系统为研究HBV的复制、治疗提供了新途径。只是该模型中植入的人肝细胞只能在有限的时间内发挥作用，致使其不能长期研究。
②移植人肝细胞的免疫缺陷鼠模型：为了使植入的人肝细胞在鼠体内存活时间延长，人们探索将人肝细胞植入到免疫缺陷的小鼠肝脏构建模型。资料显示［19］，在缺失RAG2的小鼠肝脏内注射含HBV基因的永生化肝细胞，可长时间产生HBV，鼠内病毒滴度持续5个月之久。蒋黎等［20］报道在孕鼠子宫内注射人胎肝细胞，诱导胎鼠对人肝细胞产生免疫耐受，胎鼠出生后24 h内给新生小鼠脾脏内注射人胎肝细胞，1周后接种含人HBV的血清，建立针对人胎肝细胞耐受的人鼠嵌合肝动物模型，结果在鼠肝组织中能检测到CK18、HBsAg的表达。
③uPA转基因小鼠模型：uPA即尿激酶纤维蛋白溶酶原激活物。uPA转基因鼠因其肝细胞能特异表达AlbuPA转基因，诱导携带有该基因的肝细胞凋亡，引起肝细胞特异性损伤，从而利于移植细胞在该肝脏中的长期存活。Dandri等［21］将uPA转基因鼠跟RAG2基因缺陷鼠杂交，后代被植入旱獭肝细胞，由于RAG2基因缺陷鼠不能表达RAG2，故T、B淋巴细胞不能成熟，不具备完整的免疫功能，对外源肝细胞不排斥。因此，植入的肝细胞不断生长几乎取代整个鼠肝脏，且鼠内存在旱獭病毒的感染及复制。有报道［22］称人肝细胞植入2~3周龄的UPA/RAG2鼠内，在鼠肝中观察到人肝细胞特有因子表达及人肝细胞和鼠肝实质间出现胆管沟通。另有实验报道，给纯合子SCIDUPA杂交鼠植入人原代肝细胞后可以形成几乎完全的人肝细胞化的鼠肝脏。给该模型接种含HBV血清可长达5个月之久观察到高滴度的HBV［23］。该嵌合体作为研究HBV体内感染的小鼠模型，可反映HBV自然感染的全过程，优于黑猩猩及其他动物模型，但不适合用于研究HBV发病机制。
目前用于乙型肝炎相关研究的模型主要存在的问题是未能建立起在生物学分类上与人类相近，并具有感染率高，感染持续时间长，感染后肝组织或肝细胞的病理改变类似人乙型肝炎以及经济适用的研究模型。据以上所述，黑猩猩、树鼩等灵长类动物跟人类亲缘关系相近，更适合用于研究HBV感染，但这类动物珍贵难得而应用受到限制。应用较多的还是鸭、转基因鼠和HBV细胞模型，土拨鼠模型则在国外应用较多。但无论是非人类灵长类动物模型，还是简单易得的其他模型，作为有实验价值的HBV感染模型，必须具备2个条件：一是要有高水平的HBV基因表达及复制；二是要伴有持续性病毒复制和基因表达的慢性HBV感染。总之，建立对人HBV易感，且具有与人感染HBV后相同或相似的肝脏病理改变及疾病转归研究模型，将能促进人类攻克乙型肝炎的进程。
参考文献
［1］Feleszko W, Mlynarczuk I, Oslzewska D, et al. Lovastatin potentiates antitumor activity of doxorubicin in murine melanoma via an apoptosis-dependent mechanism［J］. Int J Cancer, 2002, 100: 111-118.
［2］尤向辉，任 军，李 锋，等. RNAi载体构建及其对PLC/PRF/5细胞突变p53基因抑制作用的实验研究［J］. 现代肿瘤医学，2005，13（2）：161-164.
［3］刘志英，黄玉波，魏红山，等.表达HBeAg和HBsAg对HepG2细胞系细胞因子分泌及ACE活性的影响［J］.世界华人消化杂志 2006，14(9):904-907.
［4］闵 军，陈积圣，刘彦文，等.转乙型肝炎病毒X基因肝癌细胞株的建立［J］.中华实验外科学杂志，2000，17：231-232.
［5］ 唐 盈，王燕菲.针对HBVS基因的反义锁核酸抗乙肝病毒表达的初探［J］.江西医学,2006，41（4）：205-208.
［6］Sprinzl MF,Oberwinker H,Schaller H,et al.Transfer of hepatitis B virus genome by adenovirus vectors into cultured cells and mice:crossing the species barrier［J］.J virol,2001,75:5108-5118.
［7］王树声，苏建家，冯百芳，等.树鼩、熊猴感染人乙型肝炎病毒肝细胞内感染指征的应用［J］.中华实验和临床病毒学杂志，2003，17（3）：244-246.
［8］王文逸，黄宇闻，陆 萍，等.利用鸭乙型肝炎病毒感染模型评价血液成分中病毒的灭活效果［J］.微生物与感染，2006，1（1）：21-24.
［9］Cote PJ,Korbs BE,Miller RH,et al.Effects of age and viral determinants on chronicity as an outcome of experimental woodchunk hepatitis virus infection［J］.Heacology,2000,31(1):190-200.
［10］张 珺，王宝菊，孟忠吉，等.旱獭肝组织中嗜肝病毒表面抗原表达的免疫组化研究［J］.华中医学杂志，2003，27（5）：231-232.
［11］屠亚军，祖 和，杨 鹏，等.人乙型肝炎病毒X基因转基因小鼠模型的建立［J］.中国医学科学院学报，2006，22（3）：263-265.
［12］Uprichard SL,Boyd B,Althage A,et al.Clearance of hepatitis B virus from the liver of transgenic mice by short hairpin RNAs［J］.Proc Natl Acad sci USA,2005,102:773-778.
［13］能一力，刘光泽，贾彦征.HBV转基因小鼠免疫耐受机制的实验研究［J］.世界华人消化杂志，2002，10（6）：642-645.
［14］Dunsford HA,Sell S,Chisari FV,et al.Altered expression of hepatic carcinogen metabolizing enzymes with liver injury in HBV transgenic mouse lineages expressing various amounts of hepatitis B surface antigen［J］.Liver,1999,19(2):81-87.
［15］Xu E,Yen TS,Wul,et al.Enhancement of hepatitis B virus replication by its X protein in transgenic mice［J］.J virol,2002,76(5):2579-84.
［16］Sprinzl MF,Oberwinkler H,Schaller H,et al.Transfer of hepatitis B virus genome by adenovirus vectors into cultured cells and mice:crossing the species barrie［J］.J virol,2001,75(11):5108-5118.
［17］Klein C,Bock CT,Wedemeyer H,et al.Inhibition of hepatitis B virus replication in vivo by nucleoside analogues and siRNA［J］.Gastroenterology,2003,125:9-18.
［18］Tlan E,Burakova T,Dagan S,et al.The hepatitis B virus trimera mouse:a model for human HBV infection and evaluation of anti-HBV therapeutic ageuts［J］.Hepatology,1999,29(2):553-562.
［19］Brown JJ,Parashar B,Moshage H,et al.A long-term hepatitis B viremia model generated by transplanting nontumrigenic immortalized human hepatocytes in Rag2deficient mice［J］.Hepatology,2000,31:173-181.
［20］蒋 黎，毛 青，王宇明，等.HBV感染的鼠嵌合肝动物模型的建立［J］.第三军医大学学报，2003，25（5）：5.
［21］Petersen J,Dandri M,Gupta S,et al.Liver repopulation with xenogenic hepatocyes in B and T cell deficient mice leads to chronic hepadmarirus infection and clonal growth of hepatocellular carcinoma［J］.Proc Natl Acad Sci USA,1998,95:310-315.
［22］Dandri M,Burda MR,Torok E,et al.Repupolation of mouse liver with human hepatacytes and in vivo infection with hepatitis B virus［J］.Hepatology,2001,33:981-988.
［23］Tsuge M,Hiraga N,Tataishi H,et al.Infection of human hepatocyte chimeric mouse with genetically engineered hepatitis B virus［J］.Hepatology,2005,42:1046-1054.
［24］kayo R,Kajita I,Cho s,et al.A study on insertion of a nasogastric tube in intubated patients［J］.Masui,2005,54(9):1034-1036.
［25］karagama YG,Lancaster JL,Karkanevatos A.Nasogastric tube insertion using flexible fibreoptic nasoendoscope［J］.Hosp med,2001,62(6):336-337.
［26］王华珍，卢月珍，唐良春. 机械通气患者肠内营养与肠外营养支持对撤机时间的影响［J］.中华护理杂志，2003，38（5）：325.
［27］王曙红，刘晶成，周建辉. 手势对机械通气患者身心感受的影响［J］.中华护理杂志，2003，38（5）：394.
［28］潘 瑛，王 妍，李雪枚.1例高龄“Ⅱ型呼吸衰竭”并发DIC的护理［J］.中国实用护理杂志，2006，22（11）：65.
［29］赵禾欣，姚 莉，李红英，等.慢性阻塞性肺疾病患者行机械通气期间肢体功能锻炼的研究［J］.中华护理杂志，2003，38（8）：626.
(收稿日期：2007-09-17 修回日期：2008-04-03)
(编辑：崔群飞)