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摘要：为确定超声辅助提取葎草多糖的最佳工艺条件，通过单因素试验确定液料比、超声功率、超声温度、超声时间等因素的较适宜范围，并应用二次通用旋转设计优化提取工艺条件。超声辅助提取葎草多糖的最佳工艺条件为：液料比34 mL ∶1 g，超声功率134 W，超声温度61 ℃，超声时间49 min，此时多糖提取率为352%。经二次通用旋转设计优化后的葎草多糖提取工艺具有试验次数少、计算简单、准确可靠等优点，工艺稳定可行。
关键词：葎草多糖；超声辅助提取；单因素试验；二次通用旋转设计
中图分类号： R284.2文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）09-0308-04
葎草[Humulus scandens （Lour.）Merr.]别称勒草、涩萝蔓、拉拉秧、五爪龙等，为多年生茎蔓草本植物，是广泛分布于我国（除新疆、青海、西藏外）各省份的常见杂草，其嫩茎和叶可作为食草动物饲料。葎草是我国重要的中药材，其味甘苦、寒、无毒，具有清热解毒、利尿消肿的功效[1]。现代药理学研究证实，葎草提取物具有抗菌、抗炎、止泻抑菌、降压、镇痛等作用[2]。葎草中含有多糖、黄酮类化合物、胆碱、天门冬酰胺、挥发油、鞣质等成分。近年来，对葎草中黄酮化合物、挥发油的成分与药理研究已取得一些进展，葎草黄酮类化合物主要包含秋英苷（cosmosiin）、本犀草素-7-葡萄糖苷（luteolin-7-D-glrcoside）、牡荆素（vitexin）等；挥发油主要包含β-葎草烯（β-humulene）、石竹烯（caryophyllene）、α-古巴烯（α-copaene）、α-，β-芹子烯（α-，β-selinene）、γ-毕澄茄烯（γ-cadinene）、苯甲醇、苯乙醇等[3]，然而关于葎草多糖的报道极为少见。超声波辅助法具有简单、便捷、安全等优点，可缩短提取时间，增大多糖萃取率，目前已被广泛应用于植物多糖的提取。本研究采用超声波辅助法提取葎草多糖，并应用二次通用旋转设计优化提取工艺，以期为葎草资源的有效开发利用提供科学依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1原料与试剂葎草采自吉林工商学院周边农田，去掉根部及枯黄部分，洗净后于60 ℃干燥8 h，粉碎后过60目筛，保存备用。葡萄糖标准品购自上海华蓝化学科技有限公司，蒽酮、浓硫酸、乙醇等试剂均为分析纯，试验用水为去离子水。
1.1.2仪器KQ200-KDV型超声波清洗器（江苏省昆山市超声仪器有限公司），UV-160A型紫外可见分光光度计（日本岛津公司），R-301型旋转蒸发器（上海科升仪器有限公司），SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵（河南郑州长城仪器有限公司），TGL-20M型离心机（湘潭湘仪仪器有限公司），FW177型中草药粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司）。
1.2方法
1.2.1原料的预处理将粉碎后的原料按液料比5 mL ∶1 g加入石油醚，回流脱脂2次，每次1.5 h，滤去石油醚，滤渣挥干后获得预处理葎草粉末。
1.2.2葎草多糖的提取将预处理葎草粉末按一定液料比加入水中，浸泡2 h后置于超声波清洗器，固定超声频率为 40 kHz，以不同超声功率、超声温度、超声时间进行提取。提取结束后过滤，用旋转蒸发仪将滤液浓缩至适当体积，加入3倍体积的95%乙醇醇沉24 h，离心烘干至恒质量。采用Sevage的方法[4]除去蛋白质，离心并取上清液进行浓缩，加入3倍体积的95%乙醇醇沉，所得沉淀用乙醇、丙酮、乙醚反复洗涤，真空烘干后得到葎草多糖。
1.3试验设计
针对影响葎草多糖提取率的各因素进行单因素试验，并采用二次通用旋转设计优化提取工艺条件。固定超声功率120 W、超声温度50 ℃、超声时间50 min，分别按10 mL ∶1 g、20 mL ∶1 g、30 mL ∶1 g、40 mL ∶1 g、50 mL ∶1 g的液料比提取葎草多糖，以确定超声辅助提取葎草多糖较适宜的液料比。固定液料比30 mL ∶1 g、超声温度50 ℃、超声时间50 min，分别按80、100、120、140、160 W的超声功率提取葎草多糖，以确定超声辅助提取葎草多糖较适宜的超声功率。固定液料比 30 mL ∶1 g、超声功率120 W、超声时间50 min，分别按30、40、50、60、70 ℃的超声温度提取葎草多糖，以确定超声辅助提取葎草多糖较适宜的超声温度。固定液料比30 mL ∶1 g、超声功率120 W、超声温度50 ℃，分别按10、30、50、70、90 min 的超声时间提取葎草多糖，以确定超声辅助提取葎草多糖较适宜的超声时间。在确定各因素的适宜范围后，以葎草多糖提取率为指标，作4因素5水平的二次通用旋转设计，优化超声辅助提取葎草多糖的工艺条件。
1.4分析及测定方法
采用蒽酮-硫酸法测定总糖含量[5]，采用二硝基水杨酸法测定还原糖含量[6]，多糖提取率按下式计算：
C=m1-m2m×100%。
式中：C为多糖提取率，%；m1为样品中总糖含量，mg；m2为样品中还原糖含量，mg；m为样品的质量，mg。
2结果与分析
2.1液料比对葎草多糖提取率的影响
分别以10 mL ∶1 g、20 mL ∶1 g、30 mL ∶1 g、40 mL ∶1 g、50 mL ∶1 g的液料比提取葎草多糖，研究液料比对多糖提取率的影响。结果表明，多糖提取率随液料比的加大而增加，当液料比超过30 mL ∶1 g后多糖提取率增加不明显（图1）。较大的液料比将为后期工艺带来困难，且能耗较高，因此选择30 mL ∶1 g左右的液料比。
2.2超声功率对葎草多糖提取率的影响
分别以80、100、120、140、160 W的超声功率提取葎草多 糖，研究超声功率对多糖提取率的影响。结果表明，多糖提取率随超声功率的加大而增加，当超声功率超过140 W后多糖提取率反而下降（图2）。超声功率对葎草多糖提取率具有双向影响，前期超声功率必须达到一定强度才能产生空化作用，破坏细胞结构以便多糖的溶出；当超声功率超过140 W，超声波的机械剪切作用会加快已溶出多糖糖苷键的断裂，从而导致提取率下降，因此选择140 W左右的超声功率。
2.3超声温度对葎草多糖提取率的影响
分别以30、40、50、60、70 ℃的超声温度提取葎草多糖，研究温度对多糖提取率的影响。结果表明，多糖提取率随超声温度的升高而增加，当超声温度超过60 ℃后多糖提取率反而下降（图3）。温度越高则分子运动越强，多糖越易溶出；而过高的温度可与超声波破碎共同作用，破坏多糖的某些结构或使其降解，从而影响提取率，因此选择60 ℃左右的超声温度。
2.4超声时间对葎草多糖提取率的影响
分别以10、30、50、70、90 min的超声时间提取葎草多糖，研究超声时间对多糖提取率的影响。结果表明，多糖提取率随超声时间的延长而增加，当超声时间超过50 min后多糖提取率反而下降（图4）。前期超声波机械剪切作用和空化作用使多糖快速溶出；而长时间持续的机械剪切作用使已溶出的多糖分子糖苷键断裂， 从而降低提取率， 因此选择50 min左
右的超声时间。
2.5二次通用旋转设计优化试验结果
2.5.1数学模型的建立与显著性检验根据单因素试验结果，选取液料比、超声功率、超声温度、超声时间4个因素，以葎草多糖提取率为指标，采用二次通用旋转设计优化提取工艺，试验设计见表1，试验结果见表2，方差分析见表3。
表1二次通用旋转试验的因素与水平
因素0水平变化区间X1：液料比（mL ∶g）30 ∶15X2：超声功率（W）14010X3：超声温度（℃）605X4：超声时间（min）5010
2.5.3两因素互作效应分析由试验结果的方差分析可知，各因素间只有X2（超声功率）与X3（超声温度）存在互作效应并达到显著水平（P<0.05），所以选取其他因素为0水平，分析X2与X3的互作效应（图6）。结果表明，当X2处于较低编码范围（-2～ 1），而X3处于较高编码范围（-0.5～ 2）时，两因素互作效应明显。在该范围内固定超声温度，则多糖提取率随超声功率的加大而先升后降；在该范围内固定超声功率，则多糖提取率随超声温度的升高而先升高后缓慢下降，表明超声功率与超声温度协同作用时条件不宜过高。
2.5.4频率分析与模型寻优本研究采用频率分析法寻找最优工艺，采用DPS软件对不同设计水平下的组合进行模拟
试验，获得97个大于临界值2.94的方案，各变量取值的频率分布见表5。当X1在0.671～1.041、X2在-0.962～-0.585、X3在0.009～0.362、X4在-0.143～0.143时，多糖提取率高于2.94%的可能性为95%，此时优化提取条件为：液料比33.36 mL ∶1 g～35.21 mL ∶1 g、超声功率133.38～134.15 W、超声温度60.04～61.81 ℃、超声时间48.57～5143 min。考虑到设备的可操作性，将提取工艺条件更改为：液料比 34 mL ∶1 g、超声功率134 W、超声温度61 ℃、超声时间49 min。对此方案进行验证性试验，获得葎草多糖提取率为3.52%，接近于理论最高提取率3.49%，因此确定此组合为超声辅助提取葎草多糖的最优工艺条件。表5二次通用旋转试验各变量取值的频率分布
3结论
采用二次通用旋转设计优化超声辅助提取葎草多糖的工艺，获得的回归方程为：Y=3.352 86 0.186 67X1-0.139 17X2-0.094 67X12-0.098 42X22-0.127 17X32-0.214 67X42-0068 75X2X3。葎草多糖提取工艺条件为：液料比 34 mL ∶1 g、超声功率134 W、超声温度61 ℃、超声时间 49 min。二次通用旋转设计优化葎草多糖的提取具有试验次数少、计算简单、准确可靠等优点，可为葎草资源的有效开发提供技术参考。
参考文献：
[1]蒋益花，陈敏明. 葎草总黄酮的提取工艺和含量测定研究[J]. 浙江农业科学，2007（2）：150-153.
[2]董江涛，李燕，徐慧强，等. HPD-722大孔树脂纯化葎草总黄酮的工艺研究[J]. 辽宁农业科学，2010（3）：11-15.
[3]芦雪霞，蒋建勤. 葎草的化学成分研究[J]. 药学与临床研究，2013（3）：230-232.
[4]姚惠伶，蒋林彬. 超声波提取紫薯多糖的工艺优化[J]. 安徽农业科学，2011（14）：8357-8358，8361.
[5]王艾平，周丽明，张勇，等. 水溶性茶籽多糖提取条件研究[J]. 上饶师范学院学报，2012，32（6）：70-73.
[6]周桃英，陈年友，陈中建，等. 超声波-微波协同法提取黄精多糖工艺研究[J]. 江苏农业科学，2013，41（6）：231-233.
关键词：葎草多糖；超声辅助提取；单因素试验；二次通用旋转设计
中图分类号： R284.2文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）09-0308-04
葎草[Humulus scandens （Lour.）Merr.]别称勒草、涩萝蔓、拉拉秧、五爪龙等，为多年生茎蔓草本植物，是广泛分布于我国（除新疆、青海、西藏外）各省份的常见杂草，其嫩茎和叶可作为食草动物饲料。葎草是我国重要的中药材，其味甘苦、寒、无毒，具有清热解毒、利尿消肿的功效[1]。现代药理学研究证实，葎草提取物具有抗菌、抗炎、止泻抑菌、降压、镇痛等作用[2]。葎草中含有多糖、黄酮类化合物、胆碱、天门冬酰胺、挥发油、鞣质等成分。近年来，对葎草中黄酮化合物、挥发油的成分与药理研究已取得一些进展，葎草黄酮类化合物主要包含秋英苷（cosmosiin）、本犀草素-7-葡萄糖苷（luteolin-7-D-glrcoside）、牡荆素（vitexin）等；挥发油主要包含β-葎草烯（β-humulene）、石竹烯（caryophyllene）、α-古巴烯（α-copaene）、α-，β-芹子烯（α-，β-selinene）、γ-毕澄茄烯（γ-cadinene）、苯甲醇、苯乙醇等[3]，然而关于葎草多糖的报道极为少见。超声波辅助法具有简单、便捷、安全等优点，可缩短提取时间，增大多糖萃取率，目前已被广泛应用于植物多糖的提取。本研究采用超声波辅助法提取葎草多糖，并应用二次通用旋转设计优化提取工艺，以期为葎草资源的有效开发利用提供科学依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1原料与试剂葎草采自吉林工商学院周边农田，去掉根部及枯黄部分，洗净后于60 ℃干燥8 h，粉碎后过60目筛，保存备用。葡萄糖标准品购自上海华蓝化学科技有限公司，蒽酮、浓硫酸、乙醇等试剂均为分析纯，试验用水为去离子水。
1.1.2仪器KQ200-KDV型超声波清洗器（江苏省昆山市超声仪器有限公司），UV-160A型紫外可见分光光度计（日本岛津公司），R-301型旋转蒸发器（上海科升仪器有限公司），SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵（河南郑州长城仪器有限公司），TGL-20M型离心机（湘潭湘仪仪器有限公司），FW177型中草药粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司）。
1.2方法
1.2.1原料的预处理将粉碎后的原料按液料比5 mL ∶1 g加入石油醚，回流脱脂2次，每次1.5 h，滤去石油醚，滤渣挥干后获得预处理葎草粉末。
1.2.2葎草多糖的提取将预处理葎草粉末按一定液料比加入水中，浸泡2 h后置于超声波清洗器，固定超声频率为 40 kHz，以不同超声功率、超声温度、超声时间进行提取。提取结束后过滤，用旋转蒸发仪将滤液浓缩至适当体积，加入3倍体积的95%乙醇醇沉24 h，离心烘干至恒质量。采用Sevage的方法[4]除去蛋白质，离心并取上清液进行浓缩，加入3倍体积的95%乙醇醇沉，所得沉淀用乙醇、丙酮、乙醚反复洗涤，真空烘干后得到葎草多糖。
1.3试验设计
针对影响葎草多糖提取率的各因素进行单因素试验，并采用二次通用旋转设计优化提取工艺条件。固定超声功率120 W、超声温度50 ℃、超声时间50 min，分别按10 mL ∶1 g、20 mL ∶1 g、30 mL ∶1 g、40 mL ∶1 g、50 mL ∶1 g的液料比提取葎草多糖，以确定超声辅助提取葎草多糖较适宜的液料比。固定液料比30 mL ∶1 g、超声温度50 ℃、超声时间50 min，分别按80、100、120、140、160 W的超声功率提取葎草多糖，以确定超声辅助提取葎草多糖较适宜的超声功率。固定液料比 30 mL ∶1 g、超声功率120 W、超声时间50 min，分别按30、40、50、60、70 ℃的超声温度提取葎草多糖，以确定超声辅助提取葎草多糖较适宜的超声温度。固定液料比30 mL ∶1 g、超声功率120 W、超声温度50 ℃，分别按10、30、50、70、90 min 的超声时间提取葎草多糖，以确定超声辅助提取葎草多糖较适宜的超声时间。在确定各因素的适宜范围后，以葎草多糖提取率为指标，作4因素5水平的二次通用旋转设计，优化超声辅助提取葎草多糖的工艺条件。
1.4分析及测定方法
采用蒽酮-硫酸法测定总糖含量[5]，采用二硝基水杨酸法测定还原糖含量[6]，多糖提取率按下式计算：
C=m1-m2m×100%。
式中：C为多糖提取率，%；m1为样品中总糖含量，mg；m2为样品中还原糖含量，mg；m为样品的质量，mg。
2结果与分析
2.1液料比对葎草多糖提取率的影响
分别以10 mL ∶1 g、20 mL ∶1 g、30 mL ∶1 g、40 mL ∶1 g、50 mL ∶1 g的液料比提取葎草多糖，研究液料比对多糖提取率的影响。结果表明，多糖提取率随液料比的加大而增加，当液料比超过30 mL ∶1 g后多糖提取率增加不明显（图1）。较大的液料比将为后期工艺带来困难，且能耗较高，因此选择30 mL ∶1 g左右的液料比。
2.2超声功率对葎草多糖提取率的影响
分别以80、100、120、140、160 W的超声功率提取葎草多 糖，研究超声功率对多糖提取率的影响。结果表明，多糖提取率随超声功率的加大而增加，当超声功率超过140 W后多糖提取率反而下降（图2）。超声功率对葎草多糖提取率具有双向影响，前期超声功率必须达到一定强度才能产生空化作用，破坏细胞结构以便多糖的溶出；当超声功率超过140 W，超声波的机械剪切作用会加快已溶出多糖糖苷键的断裂，从而导致提取率下降，因此选择140 W左右的超声功率。
2.3超声温度对葎草多糖提取率的影响
分别以30、40、50、60、70 ℃的超声温度提取葎草多糖，研究温度对多糖提取率的影响。结果表明，多糖提取率随超声温度的升高而增加，当超声温度超过60 ℃后多糖提取率反而下降（图3）。温度越高则分子运动越强，多糖越易溶出；而过高的温度可与超声波破碎共同作用，破坏多糖的某些结构或使其降解，从而影响提取率，因此选择60 ℃左右的超声温度。
2.4超声时间对葎草多糖提取率的影响
分别以10、30、50、70、90 min的超声时间提取葎草多糖，研究超声时间对多糖提取率的影响。结果表明，多糖提取率随超声时间的延长而增加，当超声时间超过50 min后多糖提取率反而下降（图4）。前期超声波机械剪切作用和空化作用使多糖快速溶出；而长时间持续的机械剪切作用使已溶出的多糖分子糖苷键断裂， 从而降低提取率， 因此选择50 min左
右的超声时间。
2.5二次通用旋转设计优化试验结果
2.5.1数学模型的建立与显著性检验根据单因素试验结果，选取液料比、超声功率、超声温度、超声时间4个因素，以葎草多糖提取率为指标，采用二次通用旋转设计优化提取工艺，试验设计见表1，试验结果见表2，方差分析见表3。
表1二次通用旋转试验的因素与水平
因素0水平变化区间X1：液料比（mL ∶g）30 ∶15X2：超声功率（W）14010X3：超声温度（℃）605X4：超声时间（min）5010
2.5.3两因素互作效应分析由试验结果的方差分析可知，各因素间只有X2（超声功率）与X3（超声温度）存在互作效应并达到显著水平（P<0.05），所以选取其他因素为0水平，分析X2与X3的互作效应（图6）。结果表明，当X2处于较低编码范围（-2～ 1），而X3处于较高编码范围（-0.5～ 2）时，两因素互作效应明显。在该范围内固定超声温度，则多糖提取率随超声功率的加大而先升后降；在该范围内固定超声功率，则多糖提取率随超声温度的升高而先升高后缓慢下降，表明超声功率与超声温度协同作用时条件不宜过高。
2.5.4频率分析与模型寻优本研究采用频率分析法寻找最优工艺，采用DPS软件对不同设计水平下的组合进行模拟
试验，获得97个大于临界值2.94的方案，各变量取值的频率分布见表5。当X1在0.671～1.041、X2在-0.962～-0.585、X3在0.009～0.362、X4在-0.143～0.143时，多糖提取率高于2.94%的可能性为95%，此时优化提取条件为：液料比33.36 mL ∶1 g～35.21 mL ∶1 g、超声功率133.38～134.15 W、超声温度60.04～61.81 ℃、超声时间48.57～5143 min。考虑到设备的可操作性，将提取工艺条件更改为：液料比 34 mL ∶1 g、超声功率134 W、超声温度61 ℃、超声时间49 min。对此方案进行验证性试验，获得葎草多糖提取率为3.52%，接近于理论最高提取率3.49%，因此确定此组合为超声辅助提取葎草多糖的最优工艺条件。表5二次通用旋转试验各变量取值的频率分布
3结论
采用二次通用旋转设计优化超声辅助提取葎草多糖的工艺，获得的回归方程为：Y=3.352 86 0.186 67X1-0.139 17X2-0.094 67X12-0.098 42X22-0.127 17X32-0.214 67X42-0068 75X2X3。葎草多糖提取工艺条件为：液料比 34 mL ∶1 g、超声功率134 W、超声温度61 ℃、超声时间 49 min。二次通用旋转设计优化葎草多糖的提取具有试验次数少、计算简单、准确可靠等优点，可为葎草资源的有效开发提供技术参考。
参考文献：
[1]蒋益花，陈敏明. 葎草总黄酮的提取工艺和含量测定研究[J]. 浙江农业科学，2007（2）：150-153.
[2]董江涛，李燕，徐慧强，等. HPD-722大孔树脂纯化葎草总黄酮的工艺研究[J]. 辽宁农业科学，2010（3）：11-15.
[3]芦雪霞，蒋建勤. 葎草的化学成分研究[J]. 药学与临床研究，2013（3）：230-232.
[4]姚惠伶，蒋林彬. 超声波提取紫薯多糖的工艺优化[J]. 安徽农业科学，2011（14）：8357-8358，8361.
[5]王艾平，周丽明，张勇，等. 水溶性茶籽多糖提取条件研究[J]. 上饶师范学院学报，2012，32（6）：70-73.
[6]周桃英，陈年友，陈中建，等. 超声波-微波协同法提取黄精多糖工艺研究[J]. 江苏农业科学，2013，41（6）：231-233.