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【摘要】非霍奇金淋巴瘤（Non-hodgkins lymphoma NHL）是临床上非常常见的恶性淋巴瘤。由于抗CD20的单克隆抗体美罗华的出现，美罗华联合经典的CHOP方案已经成为NHL的标准一线治疗。但在治疗过程中也发现在复发或进展的病人中出现对美罗华的耐药，同时检测这部分病人淋巴瘤细胞表面的CD20发现存在CD20的表达下降或者丢失的现象。因此可以预见CD20的检测在NHL的美罗华靶向治疗中的意义。
【关键词】CD20；非霍奇金淋巴瘤；美罗华
doi：10.3969/j.issn.1004-7484（s）.2014.05.083文章编号：1004-7484（2014）-05-2475-02非霍奇金淋巴瘤（NHL）是一种来源于淋巴结的异质性肿瘤，被认为是淋巴细胞的发育异常，淋巴细胞在发育过程中出现不同的基因易位，这些易位的基因使潜在的细胞癌基因受到免疫球蛋白基因启动子的影响，出现细胞的异常增殖，其肿瘤细胞表面可以表达B细胞或T细胞的表面标志。NHL确切病因尚不完全明确，可能与免疫抑制，持续性的抗原刺激，或者免疫缺陷状态的EBV病毒感染有关。NHL在发达国家更常见，发病率从中国1.2人/10万到美国的15人/10万。在美国，每年约有5万例新发NHL病例，占所有恶性肿瘤的4%，是20-40岁人群肿瘤相关性死亡的主要原因[1]。在全世界，85%以上的非霍奇金淋巴瘤是成熟B細胞淋巴瘤，95%以上的B细胞NHL表达CD20。因此CD20的检测对于治疗NHL和判断其预后具有非常重要的意义。本文将就B细胞肿瘤的CD20抗原状态对美罗华耐药性的影响及可能用于临床评价的检测方法作出总结分析。
1CD20的结构及美罗华的作用机制
CD20是一种表达于B细胞表面的非糖基化疏水磷酸跨膜蛋白，大小为33-35KDa，有四个跨膜区域和一个细胞外的环状结构，广泛表达于从前B细胞（pre–Bcell）至成熟B细胞多个发育阶段，但在B细胞发育过程的首尾二端，包括造血干细胞、pro-B细胞和浆细胞阶段则表达丢失。CD20蛋白细胞外的环状结构上有美罗华的结合位点，包括二段氨基酸序列，即分别位于170-173和182-185的ANPS及YCYSI，由MS4A1基因的5号外显子编码。因此抗CD20单克隆抗体成为CD20（+）B细胞NHL重要的治疗靶点[3]。利妥昔单抗（美罗华Rituximab）是一种人鼠嵌合型CD20单克隆抗体，已经广泛应用于临床，联合CHOP化疗方案已经成为CD20（+）的B细胞非霍奇金淋巴瘤的一线治疗[2]。利妥昔单抗在体内发挥作用的确切机制主要有抗体依赖的细胞毒作用（ADCC）、补体依赖的细胞毒作用（CDC）和诱导细胞凋亡[7]。CD20在调节B细胞的增殖、活化、分化中起着非常重要的作用[13]。6-8周期的R-CHOP方案可以提高20%的总生存率[5]，但也存在首次化疗不应答率达30%-50%[2]，复发或疾病进展的B细胞NHL出现美罗华的耐药甚至抵抗的问题。
2耐药的NHL细胞表面的CD20表达下降或者丢失的可能机制
通过对耐药淋巴瘤细胞表面CD20的检测可以发现耐药的淋巴瘤细胞表面CD20表达的下降或丢失的现象[14]。CD20表达下降或者丢失或结构异常的机制主要有以下几个方面：首先，CD20在蛋白水平的变化可能主要有细胞表面CD20的“内化”或者转移至脂筏[3]，CD20在蛋白酶体中降解的增加，CD20蛋白质折叠和结构异常（一种异常的较正常短小的CD20的表达）出现异常变化导致功能学的异常，CD20合成后转移至细胞膜表面的转运异常[5]等。其次是CD20在遗传物质水平的变化（包括CD20的编码基因M4SA1基因突变和基因转录水平的异常[16]），这些变化主要包括CD20基因转录减少[8]，该机制可能源于M4SA1基因转录异常和其组蛋白脱乙酰化等表观遗传学改变使CD20基因转录的减少[5]；M4SA1基因突变导致异常CD20蛋白的表达异常（羧基末端的缺失）[4]；microRNA干涉CD20的正常表达[3]。再次可能就是美罗华药物的选择作用使原来淋巴瘤中对美罗华不敏感的CD20（-）的肿瘤细胞未被有效杀灭而出现的选择性增殖导致复发或疾病进展的病人CD20丢失出现美罗华的耐药[9]或者美罗华药物作用引起局部微环境的变化导致肿瘤细胞进化成CD20（-）[10]。以上的研究表明CD20表达的下降或丢失与美罗华的耐药有很大的关系。所以对于CD20检测的意义主要有预测靶向药物美罗华的反应，帮助评估靶向药物美罗华的疗效，帮助确定美罗华耐药的原因，协助设计个体化的治疗方案（可以通过确定CD20的分布密度决定美罗华的剂量）等。关于美罗华耐药的机制还有很多的报道，比如抑制单克隆抗体的结合、抗体在体内的代谢、补体抑制因子CD55/CD59表达[6]和膜脂筏异常[3]，DNA微卫星的不稳定性[5]，抑制凋亡基因BCL-2，BCL-6等的表达增加[15]，淋巴瘤病理类型的变化比如从滤泡性淋巴瘤进展为弥漫大B细胞淋巴瘤[11]等。
3目前CD20检测的方法
目前对于CD20的检测主要有蛋白质水平的检测和RNA水平的检测[13]。对于蛋白质水平的检测方法主要有免疫组织化学检测（IHC）和流式细胞仪检测（FCM），免疫组织化学检测只能达到对CD20的半定量检测，而流式细胞仪检测可以达到对CD20的精确定量，但因其检测需要新鲜的标本和检测费用比较高，所以还未达到免疫组织化学检测的广泛应用。但可以预见流式细胞的定量检测是一个发展的趋势。对于RNA水平的检测主要是应用RT-PCR的方法对编码CD20的mRNA的检测[12]，但由于存在有转录的RNA不一定有CD20蛋白的表达这样的问题，而且CD20蛋白合成后也可以出现转运至细胞膜表面的途径异常等，所以间接的检测mRNA不一定能完全反应CD20在细胞膜上的表达。综上分析应用流式细胞仪对细胞膜表面的CD20进行定量检测对于B细胞来源的非霍奇金淋巴瘤的治疗和预后的判断都有非常重要的意义。
【关键词】CD20；非霍奇金淋巴瘤；美罗华
doi：10.3969/j.issn.1004-7484（s）.2014.05.083文章编号：1004-7484（2014）-05-2475-02非霍奇金淋巴瘤（NHL）是一种来源于淋巴结的异质性肿瘤，被认为是淋巴细胞的发育异常，淋巴细胞在发育过程中出现不同的基因易位，这些易位的基因使潜在的细胞癌基因受到免疫球蛋白基因启动子的影响，出现细胞的异常增殖，其肿瘤细胞表面可以表达B细胞或T细胞的表面标志。NHL确切病因尚不完全明确，可能与免疫抑制，持续性的抗原刺激，或者免疫缺陷状态的EBV病毒感染有关。NHL在发达国家更常见，发病率从中国1.2人/10万到美国的15人/10万。在美国，每年约有5万例新发NHL病例，占所有恶性肿瘤的4%，是20-40岁人群肿瘤相关性死亡的主要原因[1]。在全世界，85%以上的非霍奇金淋巴瘤是成熟B細胞淋巴瘤，95%以上的B细胞NHL表达CD20。因此CD20的检测对于治疗NHL和判断其预后具有非常重要的意义。本文将就B细胞肿瘤的CD20抗原状态对美罗华耐药性的影响及可能用于临床评价的检测方法作出总结分析。
1CD20的结构及美罗华的作用机制
CD20是一种表达于B细胞表面的非糖基化疏水磷酸跨膜蛋白，大小为33-35KDa，有四个跨膜区域和一个细胞外的环状结构，广泛表达于从前B细胞（pre–Bcell）至成熟B细胞多个发育阶段，但在B细胞发育过程的首尾二端，包括造血干细胞、pro-B细胞和浆细胞阶段则表达丢失。CD20蛋白细胞外的环状结构上有美罗华的结合位点，包括二段氨基酸序列，即分别位于170-173和182-185的ANPS及YCYSI，由MS4A1基因的5号外显子编码。因此抗CD20单克隆抗体成为CD20（+）B细胞NHL重要的治疗靶点[3]。利妥昔单抗（美罗华Rituximab）是一种人鼠嵌合型CD20单克隆抗体，已经广泛应用于临床，联合CHOP化疗方案已经成为CD20（+）的B细胞非霍奇金淋巴瘤的一线治疗[2]。利妥昔单抗在体内发挥作用的确切机制主要有抗体依赖的细胞毒作用（ADCC）、补体依赖的细胞毒作用（CDC）和诱导细胞凋亡[7]。CD20在调节B细胞的增殖、活化、分化中起着非常重要的作用[13]。6-8周期的R-CHOP方案可以提高20%的总生存率[5]，但也存在首次化疗不应答率达30%-50%[2]，复发或疾病进展的B细胞NHL出现美罗华的耐药甚至抵抗的问题。
2耐药的NHL细胞表面的CD20表达下降或者丢失的可能机制
通过对耐药淋巴瘤细胞表面CD20的检测可以发现耐药的淋巴瘤细胞表面CD20表达的下降或丢失的现象[14]。CD20表达下降或者丢失或结构异常的机制主要有以下几个方面：首先，CD20在蛋白水平的变化可能主要有细胞表面CD20的“内化”或者转移至脂筏[3]，CD20在蛋白酶体中降解的增加，CD20蛋白质折叠和结构异常（一种异常的较正常短小的CD20的表达）出现异常变化导致功能学的异常，CD20合成后转移至细胞膜表面的转运异常[5]等。其次是CD20在遗传物质水平的变化（包括CD20的编码基因M4SA1基因突变和基因转录水平的异常[16]），这些变化主要包括CD20基因转录减少[8]，该机制可能源于M4SA1基因转录异常和其组蛋白脱乙酰化等表观遗传学改变使CD20基因转录的减少[5]；M4SA1基因突变导致异常CD20蛋白的表达异常（羧基末端的缺失）[4]；microRNA干涉CD20的正常表达[3]。再次可能就是美罗华药物的选择作用使原来淋巴瘤中对美罗华不敏感的CD20（-）的肿瘤细胞未被有效杀灭而出现的选择性增殖导致复发或疾病进展的病人CD20丢失出现美罗华的耐药[9]或者美罗华药物作用引起局部微环境的变化导致肿瘤细胞进化成CD20（-）[10]。以上的研究表明CD20表达的下降或丢失与美罗华的耐药有很大的关系。所以对于CD20检测的意义主要有预测靶向药物美罗华的反应，帮助评估靶向药物美罗华的疗效，帮助确定美罗华耐药的原因，协助设计个体化的治疗方案（可以通过确定CD20的分布密度决定美罗华的剂量）等。关于美罗华耐药的机制还有很多的报道，比如抑制单克隆抗体的结合、抗体在体内的代谢、补体抑制因子CD55/CD59表达[6]和膜脂筏异常[3]，DNA微卫星的不稳定性[5]，抑制凋亡基因BCL-2，BCL-6等的表达增加[15]，淋巴瘤病理类型的变化比如从滤泡性淋巴瘤进展为弥漫大B细胞淋巴瘤[11]等。
3目前CD20检测的方法
目前对于CD20的检测主要有蛋白质水平的检测和RNA水平的检测[13]。对于蛋白质水平的检测方法主要有免疫组织化学检测（IHC）和流式细胞仪检测（FCM），免疫组织化学检测只能达到对CD20的半定量检测，而流式细胞仪检测可以达到对CD20的精确定量，但因其检测需要新鲜的标本和检测费用比较高，所以还未达到免疫组织化学检测的广泛应用。但可以预见流式细胞的定量检测是一个发展的趋势。对于RNA水平的检测主要是应用RT-PCR的方法对编码CD20的mRNA的检测[12]，但由于存在有转录的RNA不一定有CD20蛋白的表达这样的问题，而且CD20蛋白合成后也可以出现转运至细胞膜表面的途径异常等，所以间接的检测mRNA不一定能完全反应CD20在细胞膜上的表达。综上分析应用流式细胞仪对细胞膜表面的CD20进行定量检测对于B细胞来源的非霍奇金淋巴瘤的治疗和预后的判断都有非常重要的意义。