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[摘要]目的观察Rho激酶在大鼠心肌细胞缺血再灌注损伤细胞凋亡中的作用，法舒地尔（fasudil，F）对缺血再灌注损伤细胞凋亡的影响。方法45只SD大鼠建立缺血再灌注损伤（IRI）模型，实验分3组：（1）空白对照组（C组）；（2）缺血再灌注+生理盐水组（IR组）；（3）缺血再灌注+法舒地尔组（FH组）。Western blot法检测肌球蛋白磷酸酶目标亚单位1（MYPT1）磷酸化水平，作为Rho激酶功能活化的标志，应用流式细胞仪检测心肌细胞的凋亡率。结果再灌注后MYPT1的磷酸化水平显著增加，IR组磷酸化MYPT1水平是正常对照组的3.66倍（P<0.01）。用法舒地尔干预后，FH组磷酸化MYPT1水平较IR组降低36.34%（正常对照组的2.33倍），FH组心肌细胞的凋亡率较IR组呈下降趋势（P<0.01）。结论Rho激酶在缺血再灌注心肌细胞中有促MYPT1磷酸化水平上调作用，法舒地尔可减少缺血再灌注心肌细胞凋亡的发生。
[关键词]法舒地尔；缺血再灌注损伤；细胞凋亡；大鼠
中图分类号：R542.2文献标识码：A文章编号：1009_816X（2014）05_0372_03
doi：10.3969/j.issn.1009_816x.2014.05.06Fasudil Mechanism on Rats with Myocardial Ischemia_reperfusion Injury. LU Yun， WU Li_yun， ZHAO Ming_hua， et al. Depatman of Medicament，Taizhou Integrated Traditional and Western Medicine Hospital， Zhejiang 317523，China
[Abstract] Objective To observe the impact of Rho_kinase on rats’ cardiac myocyte apoptosis caused by ischemia_reperfusion injury and to investigate the protective effect of fasudil （F） against cardiac myocytes apoptosis in the course of ischemia_reperfusion injury. Methods Forty_five SD rats were randomly divided into 3 groups （n=15 each） to establish IPR model. （1） Group 1 were rats without injury serving as control （group C）； （2） Group 2 were rats suffered from ischemia_reperfusion with pretreatment of normal saline （group IR） or puerarin （group PI）. （3） Group 3 were rats suffered from ischemia_reperfusion but injected with fasudil （group FH）. The Western Blot analysis was employed to measure the phosphorylation level of myosin phosphatase target subunit 1（MYPT 1）， as the index of the Rho_kinase activity. The apoptosis ratio of rats cardiac myocytes was determined by flow cytometry. Results The injection resulted in a 3.66_fold increase in the phosphorylated MYPT1 level of group IR，as compared to group C （P<0.01）. After the interference of fasudil，the phosphorylated MYPT1 level of group FH is 36.34% lower than group IR （2.33 times compared to group C）. The apoptosis probability of cardiac myocytes in group FH is significantly lower than that in group IR （P<0.01）.Conclusions Rho_kinase can increase the phosphorylated MYPT 1 level in cardiac myocytes with apoptosis caused by ischemia_reperfusion injury， and Puerarin can reduce the probability of cardiac myocytes apoptosis caused by ischemia_reperfusion injury.
[Key words] Puerarin； Ischemia_reperfusion injury； Apoptosis； Rat
缺血再灌注损伤（ischemia_reperfusion injury，IRI）是指细胞因缺血发生可逆性的损伤，在缺血纠正后这种损伤反而加重并引起细胞死亡或进一步的功能障碍。心肌梗死是老年人常见的心脏疾病，也是易引起死亡的心脏疾病之一，随着静脉溶栓、经皮冠状动脉介入治疗、冠状动脉旁路移植术等方法广泛应用于急性心肌梗死的治疗，使缺血心肌得到有效再灌注，对于挽救濒死心肌、缩小心肌梗死面积、保护心功能起到了重要的作用，但是心肌梗死后存在IRI过程，如何减轻心肌IRI已为临床所关注。心肌IRI的机制涉及氧自由基损伤、钙离子超载、细胞凋亡、内皮功能障碍等，近年研究表明，细胞凋亡是心肌IRI机制中的重要环节[1]，是心肌受损、心力衰竭发生发展的重要因素。本研究心肌IRI大鼠模型，探讨Rho激酶在缺血再灌注心肌细胞中是否有促凋亡作用，以及法舒地尔对Rho激酶水平的影响，试图为心肌缺血再灌注损伤的治疗提供一些理论依据。 1资料与方法
1.1实验动物：雄性SD大鼠45只（购于温州医学院实验动物中心，动物证号：SCXR（浙）2005_0019），清洁级，体重250～350g（7～10周龄）。饲养于恒温净化通风动物房，自由进食和饮水，室温保持（25±2）℃。
1.2主要试剂和仪器：盐酸法舒地尔（商品名川威，批号1011051，天津红日药业有限公司产品），细胞凋亡检测试剂盒和TUNEL试剂盒（购于晶美生物工程有限公司）。兔抗P2MYPT1（Thr850）抗体（Upstate公司），兔抗β_actin抗体（Santa cruz公司）；辣根酶标记山羊抗兔IgG（北京中杉金桥生物公司）；ECL试剂（Santa cruz公司）。
1.3实验分组：45只SD大鼠随机分为3组：采用数字随机法分为空白对照组（C组，n=15）、缺血再灌注+0.9%氯化钠注射液组（IR组，n=15）和缺血再灌注+法舒地尔组（FH组，n=15）。术前12h禁食不禁水。C组旷置左冠状动脉前降支30min；而IR组和FH组用0号手术线结扎左冠状动脉前降支30min，再灌注2h。C组和IR组于术前30min分别经股静脉输0.9%氯化钠注射液2ml/100g，而FH组于术前30min经股静脉注射法舒地尔5mg。术毕处死，取心尖以上缺血梗死区断面3mm厚心肌组织，去离子水漂洗3次，用现配多聚甲醛液固定。
1.4动物模型的制作：采用改进方法造模再灌注，造模时[2]：充分暴露心脏及其表面的血管，剪开心包膜，结扎冠状动脉前降支，结扎线远端心肌颜色发绀，心电图Ⅱ导联上ST段弓背上抬0.1mv和（或）T波高耸为完全结扎标志。再灌注损伤模型成功标志：缺血部位心肌颜色恢复，抬高的ST段下降50%以上。
1.5指标测定及方法：
1.5.1TUNEL法检测细胞凋亡：以背景颜色、细胞核内着棕黄色颗粒为阳性细胞。凋亡指数按文献中方法[3]计算。流式细胞仪（FACS Calibur，Becton Dickinson公司）检测细胞凋亡率。
1.5.2细胞内Ca++浓度测定：采用原子吸收分光光度法测定。
1.5.3Western blot法检测Rho激酶蛋白表达：用化学发光试剂盒检测杂交信号，以β_actin作内参，用数码成像分析系统软件对Western结果进行定量分析，光密度值表示蛋白相对表达量。
1.6统计学处理：采用SPSS11.5版统计学软件处理数据，所得计量资料用（x-±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，再进行两两比较，P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1法舒地尔对细胞内Ca++浓度、心肌细胞凋亡指数及凋亡率的影响：见表1。IR组细胞内Ca++浓度明显高于C组（P<0.01），FH组细胞内Ca++浓度比IR组显著降低（P<0.01）。
FH组胞核着色明显减弱，凋亡指数显著低于IR组（P<0.01），FH组凋亡指数高于C组（P<0.05）。IR组细胞核被染成棕褐色，细胞质复染为淡蓝色，凋亡指数明显高于C组和FH组（P<0.01）。心肌细胞缺血再灌注后流式细胞仪记录到典型的凋亡峰，其凋亡率显著高于正常对照组（P<0.01）；FH组凋亡率明显下降，与IR组比较差异有统计学意义（P<0.01）。
表1法舒地尔对心肌细胞Ca++浓度、凋亡率（AR）、
凋亡指数（AI）表达的影响
组别Ca++（nmol/L）AR（%）AI（%）FH组132.36±5.38*△32.46±1.96△13.32±〖〗1.78*△△IR组216.64±7.28*49.96±5.71*20.32±2.65*C组63.48±4.5911.42±1.284.37±0.87F19.7015.4812.35P<0.01<0.01<0.01注：与C组比较*P<0.01；与IR组比较△P<0.01，△△P<0.052.2Western blot检测Rho激酶蛋白表达：Rho激酶蛋白表达通过检测其下游底物磷酸化MYPT1（PMYPT1）水平。Rho激酶蛋白相对表达量以Rho激酶蛋白与β_actin Western blot电泳条带辉度比值表示。Rho激酶蛋白相对表达量，设对照组为100%，IR组、FH组为空白对照组的倍数。心肌细胞Rho激酶蛋白表达情况：空白对照组无激活，IR组、FH组均有激活。IR组磷酸化MYPT1水平是C组的3.66倍（P<0.01）。用法舒地尔干预后，FH组磷酸化MYPT1水平较IR组降低36.34%（C组的2.33倍），差异具有统计学意义（P<0.05）。
图1Rho激酶蛋白表达3讨论
Rho激酶有两种异构体：ROCKⅠ和ROCKⅡ。激活状态的RhoA与ROCK结合，ROCK进一步磷酸化其下游底物（MYPT1），从而调节细胞的多种行为，包括细胞形状改变、迁移、基因转录、细胞周期调控等。法舒地尔是Rho激酶特异抑制剂，通过与ATP竞争Rho激酶催化区的ATP结合位点，而抑制Rho激酶的活性，对ROCKI和ROCKII有同等效力[4]。法舒地尔参与了平滑肌收缩、细胞骨架的重构、应力纤维的形成、细胞分化与转移、细胞凋亡等多种细胞功能。最新研究提示长时间持续缺血或短暂缺血后再灌注可以引起心肌细胞凋亡[5]。而凋亡是缺血性心脏疾病细胞死亡的重要方式，是缺血再灌注损伤的特征性的病理生理变化。
本文研究发现，当心肌细胞遭遇缺血再灌注时细胞内明显Ca++超载，TUNEL染色检测到大量的凋亡细胞，流式细胞仪纪录到典型的凋亡峰，细胞凋亡指数和凋亡百分率显著高于正常对照组。说明心肌缺血再灌注损伤时，心肌细胞出现明显的凋亡细胞。法舒地尔注射液干预后FH组心肌凋亡细胞明显减少，细胞内Ca++浓度比IR组显著降低（P<0.01），凋亡率、凋亡指数均显著低于IR组（P<0.01）（表1）。心肌细胞凋亡明确存在于缺血再灌注损伤的过程中[6]，法舒地尔注射液对心肌缺血再灌注损伤有明显的保护作用。
[关键词]法舒地尔；缺血再灌注损伤；细胞凋亡；大鼠
中图分类号：R542.2文献标识码：A文章编号：1009_816X（2014）05_0372_03
doi：10.3969/j.issn.1009_816x.2014.05.06Fasudil Mechanism on Rats with Myocardial Ischemia_reperfusion Injury. LU Yun， WU Li_yun， ZHAO Ming_hua， et al. Depatman of Medicament，Taizhou Integrated Traditional and Western Medicine Hospital， Zhejiang 317523，China
[Abstract] Objective To observe the impact of Rho_kinase on rats’ cardiac myocyte apoptosis caused by ischemia_reperfusion injury and to investigate the protective effect of fasudil （F） against cardiac myocytes apoptosis in the course of ischemia_reperfusion injury. Methods Forty_five SD rats were randomly divided into 3 groups （n=15 each） to establish IPR model. （1） Group 1 were rats without injury serving as control （group C）； （2） Group 2 were rats suffered from ischemia_reperfusion with pretreatment of normal saline （group IR） or puerarin （group PI）. （3） Group 3 were rats suffered from ischemia_reperfusion but injected with fasudil （group FH）. The Western Blot analysis was employed to measure the phosphorylation level of myosin phosphatase target subunit 1（MYPT 1）， as the index of the Rho_kinase activity. The apoptosis ratio of rats cardiac myocytes was determined by flow cytometry. Results The injection resulted in a 3.66_fold increase in the phosphorylated MYPT1 level of group IR，as compared to group C （P<0.01）. After the interference of fasudil，the phosphorylated MYPT1 level of group FH is 36.34% lower than group IR （2.33 times compared to group C）. The apoptosis probability of cardiac myocytes in group FH is significantly lower than that in group IR （P<0.01）.Conclusions Rho_kinase can increase the phosphorylated MYPT 1 level in cardiac myocytes with apoptosis caused by ischemia_reperfusion injury， and Puerarin can reduce the probability of cardiac myocytes apoptosis caused by ischemia_reperfusion injury.
[Key words] Puerarin； Ischemia_reperfusion injury； Apoptosis； Rat
缺血再灌注损伤（ischemia_reperfusion injury，IRI）是指细胞因缺血发生可逆性的损伤，在缺血纠正后这种损伤反而加重并引起细胞死亡或进一步的功能障碍。心肌梗死是老年人常见的心脏疾病，也是易引起死亡的心脏疾病之一，随着静脉溶栓、经皮冠状动脉介入治疗、冠状动脉旁路移植术等方法广泛应用于急性心肌梗死的治疗，使缺血心肌得到有效再灌注，对于挽救濒死心肌、缩小心肌梗死面积、保护心功能起到了重要的作用，但是心肌梗死后存在IRI过程，如何减轻心肌IRI已为临床所关注。心肌IRI的机制涉及氧自由基损伤、钙离子超载、细胞凋亡、内皮功能障碍等，近年研究表明，细胞凋亡是心肌IRI机制中的重要环节[1]，是心肌受损、心力衰竭发生发展的重要因素。本研究心肌IRI大鼠模型，探讨Rho激酶在缺血再灌注心肌细胞中是否有促凋亡作用，以及法舒地尔对Rho激酶水平的影响，试图为心肌缺血再灌注损伤的治疗提供一些理论依据。 1资料与方法
1.1实验动物：雄性SD大鼠45只（购于温州医学院实验动物中心，动物证号：SCXR（浙）2005_0019），清洁级，体重250～350g（7～10周龄）。饲养于恒温净化通风动物房，自由进食和饮水，室温保持（25±2）℃。
1.2主要试剂和仪器：盐酸法舒地尔（商品名川威，批号1011051，天津红日药业有限公司产品），细胞凋亡检测试剂盒和TUNEL试剂盒（购于晶美生物工程有限公司）。兔抗P2MYPT1（Thr850）抗体（Upstate公司），兔抗β_actin抗体（Santa cruz公司）；辣根酶标记山羊抗兔IgG（北京中杉金桥生物公司）；ECL试剂（Santa cruz公司）。
1.3实验分组：45只SD大鼠随机分为3组：采用数字随机法分为空白对照组（C组，n=15）、缺血再灌注+0.9%氯化钠注射液组（IR组，n=15）和缺血再灌注+法舒地尔组（FH组，n=15）。术前12h禁食不禁水。C组旷置左冠状动脉前降支30min；而IR组和FH组用0号手术线结扎左冠状动脉前降支30min，再灌注2h。C组和IR组于术前30min分别经股静脉输0.9%氯化钠注射液2ml/100g，而FH组于术前30min经股静脉注射法舒地尔5mg。术毕处死，取心尖以上缺血梗死区断面3mm厚心肌组织，去离子水漂洗3次，用现配多聚甲醛液固定。
1.4动物模型的制作：采用改进方法造模再灌注，造模时[2]：充分暴露心脏及其表面的血管，剪开心包膜，结扎冠状动脉前降支，结扎线远端心肌颜色发绀，心电图Ⅱ导联上ST段弓背上抬0.1mv和（或）T波高耸为完全结扎标志。再灌注损伤模型成功标志：缺血部位心肌颜色恢复，抬高的ST段下降50%以上。
1.5指标测定及方法：
1.5.1TUNEL法检测细胞凋亡：以背景颜色、细胞核内着棕黄色颗粒为阳性细胞。凋亡指数按文献中方法[3]计算。流式细胞仪（FACS Calibur，Becton Dickinson公司）检测细胞凋亡率。
1.5.2细胞内Ca++浓度测定：采用原子吸收分光光度法测定。
1.5.3Western blot法检测Rho激酶蛋白表达：用化学发光试剂盒检测杂交信号，以β_actin作内参，用数码成像分析系统软件对Western结果进行定量分析，光密度值表示蛋白相对表达量。
1.6统计学处理：采用SPSS11.5版统计学软件处理数据，所得计量资料用（x-±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，再进行两两比较，P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1法舒地尔对细胞内Ca++浓度、心肌细胞凋亡指数及凋亡率的影响：见表1。IR组细胞内Ca++浓度明显高于C组（P<0.01），FH组细胞内Ca++浓度比IR组显著降低（P<0.01）。
FH组胞核着色明显减弱，凋亡指数显著低于IR组（P<0.01），FH组凋亡指数高于C组（P<0.05）。IR组细胞核被染成棕褐色，细胞质复染为淡蓝色，凋亡指数明显高于C组和FH组（P<0.01）。心肌细胞缺血再灌注后流式细胞仪记录到典型的凋亡峰，其凋亡率显著高于正常对照组（P<0.01）；FH组凋亡率明显下降，与IR组比较差异有统计学意义（P<0.01）。
表1法舒地尔对心肌细胞Ca++浓度、凋亡率（AR）、
凋亡指数（AI）表达的影响
组别Ca++（nmol/L）AR（%）AI（%）FH组132.36±5.38*△32.46±1.96△13.32±〖〗1.78*△△IR组216.64±7.28*49.96±5.71*20.32±2.65*C组63.48±4.5911.42±1.284.37±0.87F19.7015.4812.35P<0.01<0.01<0.01注：与C组比较*P<0.01；与IR组比较△P<0.01，△△P<0.052.2Western blot检测Rho激酶蛋白表达：Rho激酶蛋白表达通过检测其下游底物磷酸化MYPT1（PMYPT1）水平。Rho激酶蛋白相对表达量以Rho激酶蛋白与β_actin Western blot电泳条带辉度比值表示。Rho激酶蛋白相对表达量，设对照组为100%，IR组、FH组为空白对照组的倍数。心肌细胞Rho激酶蛋白表达情况：空白对照组无激活，IR组、FH组均有激活。IR组磷酸化MYPT1水平是C组的3.66倍（P<0.01）。用法舒地尔干预后，FH组磷酸化MYPT1水平较IR组降低36.34%（C组的2.33倍），差异具有统计学意义（P<0.05）。
图1Rho激酶蛋白表达3讨论
Rho激酶有两种异构体：ROCKⅠ和ROCKⅡ。激活状态的RhoA与ROCK结合，ROCK进一步磷酸化其下游底物（MYPT1），从而调节细胞的多种行为，包括细胞形状改变、迁移、基因转录、细胞周期调控等。法舒地尔是Rho激酶特异抑制剂，通过与ATP竞争Rho激酶催化区的ATP结合位点，而抑制Rho激酶的活性，对ROCKI和ROCKII有同等效力[4]。法舒地尔参与了平滑肌收缩、细胞骨架的重构、应力纤维的形成、细胞分化与转移、细胞凋亡等多种细胞功能。最新研究提示长时间持续缺血或短暂缺血后再灌注可以引起心肌细胞凋亡[5]。而凋亡是缺血性心脏疾病细胞死亡的重要方式，是缺血再灌注损伤的特征性的病理生理变化。
本文研究发现，当心肌细胞遭遇缺血再灌注时细胞内明显Ca++超载，TUNEL染色检测到大量的凋亡细胞，流式细胞仪纪录到典型的凋亡峰，细胞凋亡指数和凋亡百分率显著高于正常对照组。说明心肌缺血再灌注损伤时，心肌细胞出现明显的凋亡细胞。法舒地尔注射液干预后FH组心肌凋亡细胞明显减少，细胞内Ca++浓度比IR组显著降低（P<0.01），凋亡率、凋亡指数均显著低于IR组（P<0.01）（表1）。心肌细胞凋亡明确存在于缺血再灌注损伤的过程中[6]，法舒地尔注射液对心肌缺血再灌注损伤有明显的保护作用。