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[摘要] 目的 建立高效液相色谱法检测氨酪酸氯化钠注射液中α-吡咯烷酮含量的方法标准。 方法 选用CAPCELL PAK C18柱为色谱柱；流动相采用pH2.1的磷酸二氢钾溶液-甲醇（90：10）；流速维持在1.0mL/min；紫外检测波长设定为210nm；柱温为30℃；进样量为10μL。 结果 α-吡咯烷酮浓度为0.4～5.0mg/L 时其线性关系良好，r=0.9998，平均回收率为100.27%（RSD=0.54%，n=6）。 结论 本研究建立的HPLC法对于氨酪酸氯化钠注射液中的α-吡咯烷酮测定效果良好且方便快捷。
[关键词] 氨酪酸氯化钠注射液；α-吡咯烷酮；含量测定；高效液相色谱法
[中图分类号] R927.1 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2014）22-87-03
氨酪酸（aminobutyric acid）又称γ-氨酪酸、γ-氨基丁酸，是一类氨基酸类抑制性中枢神经递质，在体内可促进葡萄糖磷酸酯酶的激活，从而改善脑细胞功能的恢复，对于脑卒中、动脉硬化症等脑血管疾病及其导致的偏瘫、语言障碍，头部外伤，CO中毒，儿童发育迟缓等具有一定的治疗作用[1-2]。此外，其还可与血氨结合，促进其通过尿液排出，从而降低血氨水平，在肝昏迷的辅助治疗中也广泛应用[3]。目前，临床中使用的剂型多采用氨酪酸氯化钠注射液，然而该品种并未被美国及欧洲药典收载，虽然国家药品标准收载多个质量标[4-7]，但均未完善。近年来，药物监管力度逐渐加强，对于氨酪酸氯化钠注射液的质量要求也逐渐提高，国药典化发[2010]84号文件的发布也要求增加氨酪酸氯化钠注射液中有关物质检查，以防止药物不良反应的发生[8]。目前，对于氨酪酸氯化钠注射液中α-吡咯烷酮的检测研究较少，缺少统一的测定标准。本研究采用高效液相色谱法（HPLC）对氨酪酸氯化钠注射液中α-吡咯烷酮进行检测，旨在为氨酪酸氯化钠注射液中α-吡咯烷酮的检测提供方法标准。
1 仪器与试剂
1.1 仪器
Agilent 1200型高效液相色谱仪：主要包括单元泵、柱温箱、自动进样器、紫外检测器、Agilent色谱工作站及相关检测与分析软件。
1.2 试剂
氨酪酸氯化钠注射液（安徽双鹤药业有限责任公司，批号：20101009、20101011、20101015；山东齐都药业有限公司，批号：10120903）；α-吡咯烷酮（东北制药总厂提供）；甲醇（色谱纯，天津市康科德科技有限公司）；实验用水均为超纯水；磷酸二氢钾、己烷磺酸钠、磷酸等试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱选用CAPCELL PAK C18柱；流动相采用pH 2.1的磷酸二氢钾溶液-甲醇（90∶10），磷酸二氢钾溶液配置流程如下：准确称取磷酸二氢钾10.0g及己烷磺酸钠1.1g，加水稀释，后利用磷酸调整pH为2.1，定容至1000mL；流速维持在1.0mL/min；紫外检测波长设定为210nm；柱温为30℃；进样量为10μL。
2.2 溶液制备及色谱分析
2.2.1 对照品溶液的制备 取α-吡咯烷酮对照品适量，采用蒸馏水溶解并稀释至其浓度约为4μg/mL，作为对照品溶液，备用。
2.2.2 供试品溶液制备 精确移取5mL氨酪酸氯化钠注射液至25mL的量瓶内，蒸馏水稀释至刻度并混匀，备用。
2.2.3 阴性对照溶液制备 准确称取NaCl 0.9g，加水溶解，置入100mL容量瓶，定容，以制备0.9%氯化钠溶液，作为阴性对照溶液使用。
2.2.4 色谱图 对于上述已制备完成的对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各取10μL进样，进行液相色谱分离，记录色谱图。供试品及对照品溶液中α-吡咯烷酮对应峰的保留时间一致，表明HPLC能够有效的分离氨酪酸氯化钠注射液中的α-吡咯烷酮，且阴性对照未出现干扰。
2.3 线性关系试验
分别取对照品溶液1，5，10，15，20μL进样，进行液相色谱分析并记录各自的色谱图，后以α-吡咯烷酮的浓度为X轴，以对应的色谱峰峰面积为Y轴，绘制散点图并行线性回归分析，则有Y=7.052X-0.154，r=0.9998，α-吡咯烷酮浓度为0.4～5.0mg/L时其线性关系良好，可进行α-吡咯烷酮浓度的测定。
2.4 精密度试验
采用对照品溶液进样，连续重复5次，每次进样10μL，记录各自的色谱图，根据各色谱图α-吡咯烷酮对应峰的峰面积计算RSD为0.69%。
2.5 供试品溶液稳定性试验
于0，2，4，6，8，12h分别取供试品溶液10μL进样，行液相色谱分析，并记录各色谱图，测量各不同时间点供试品α-吡咯烷酮对应峰的峰面积，计算峰面积的RSD，结果显示，RSD为0.28%，表明氨酪酸氯化钠注射液在12h内较为稳定。
2.6 重复性试验
取同批次供试品6份，每份取10mL，置于50mL量瓶中，0.9%氯化钠溶液定容至刻度，各取10μL进样进行色谱分离，计算6份溶液中α-吡咯烷酮的含量，结果依次为0.141%、0.140%、0.138%、0.139%、0.140%和0.142%，计算平均含量为0.140%，RSD为1.01%。
2.7 回收率试验
配制已知α-吡咯烷酮浓度的氨酪酸氯化钠溶液，连续取6份，10mL/份，转入50mL量瓶内，后分别加入40.225μg/mLα-吡咯烷酮溶液5ml，采用0.9%的氯化钠溶液稀释至刻度，分别取10μL进样，进行液相色谱分离，记录色谱图，计算会回收率及RSD，如表1所示。结果显示，平均回收率为100.27%，6份样品回收率的RSD为0.54%。 2.8 检出限
检出限测定溶液的配制如下：取适量对照品溶液，使用蒸馏水稀释至α-吡咯烷酮浓度为0.4μg/mL。移取1μL检出限测定溶液进样，行高效液相色谱，以S/N=3计算检出限，结果显示，α-吡咯烷酮的检出限为0.4ng。
2.9 样品测定
采用来自不同厂家、不同批次间的氨酪酸氯化钠注射液作为供试品，制备供试品溶液，分别采用国标法及HPLC法测定样品中α-吡咯烷酮的含量，结果如表2。安徽双鹤药业有限公司的3批样品中α-吡咯烷酮含量分别为0.141%、0.143%、0.140%，山东齐都药业有限公司的1批样品中α-吡咯烷酮含量为0.117%。
3 讨论
氨酪酸（aminobutyric acid）是一种小分子两性氨基酸，作为抑制中枢神经的递质，能够促进脑细胞功能恢复，对于脑血管疾病及后遗症、中毒昏迷等的治疗具有重要作用。目前临床所用多为注射液，不仅有效防止药液暴露，造成微生物、粉尘等的二次污染，同时增加了药物的安全性及便捷性[9]。
对于氨酪酸的制备工艺，经过文献检索和生产要求，主要包括化学水解法和生物酶解法两类，其中，化学水解法主要是在138～142℃高温下利用氢氧化钙水解α-吡咯烷酮所得；生物酶解法主要是通过培养表达4-丁内酰胺水解酶的菌株，利用4-丁内酰胺水解酶对于α-吡咯烷酮的水解作用制的[10-12]。由于两种方法均以α-吡咯烷酮作为底物，在生产过程中往往难以充分将α-吡咯烷酮彻底转化，不可避免的在氨酪酸中存在，然而，作为一种高毒性的化学物质，α-吡咯烷酮的残余，往往会导致不良反应的发生[13]，因此，加强对于氨酪酸氯化钠注射液α-吡咯烷酮的含量检测对于提高药品质量具有重要作用。
本研究中选用CAPCELL PAK C18柱为色谱柱；流动相采用pH 2.1的磷酸二氢钾溶液-甲醇（90∶10）；流速维持在1.0mL/min；检测波长为210nm；柱温为30℃；进样量为10μL，此条件下进行HPLC检测发现，对于α-吡咯烷酮具有较好的分离度，线性关系及回收率均能达到试验要求。其中，对于流动相的选择，采用现行氨酪酸氯化钠注射液质量标准中的流动相进行，未取得理想结果，故采用磷酸二氢钾溶液-甲醇（90∶10）（pH=2.1）进行。此外，采用磷酸二氢钾溶液-甲醇（90∶10）（pH=2.1）流动相溶液制备α-吡咯烷酮对照品溶液，后采用紫外检测在200～400nm的波长范围内扫描，未发现特征吸收，仅在紫外末端区有吸收，且阴性对照无干扰出现，因此，选取210nm作为测定波长。
综上所述，本研究介绍的HPLC法测定氨酪酸氯化钠注射液中的α-吡咯烷酮具有较好的效果，为改善氨酪酸氯化钠注射液的质量标准提供了理论依据。
[参考文献]
[1] 刘艳，徐玉文，李玉梅，等.高效液相色谱法测定氨酪酸氯化钠注射液中的α-吡咯烷酮[J].中国生化药物杂志，2012，33（4）：422-424.
[2] 林谦.γ-氨基丁酸的生理功能概述[J].玉林师范学院学报，2010，31（2）：62-65.
[3] 梁叶.高压氧联合氨酪酸治疗一氧化碳中毒迟发性脑病效果观察[J].中国医疗前沿，2013（17）：34，109.
[4] 国家药典委员会YBH02622006（氨酪酸氯化钠注射液），国家食品药品监管局药品标准（试行）[S].2006.
[5] 国家药典委员会YBH40692005（氨酪酸氯化钠注射液），国家食品药品监管局药品标准（试行）[S].2005.
[6]国家药典委员会YBH33742005（氨酪酸氯化钠注射液），国家食品药品监管局药品标准（试行）[S].2005.
[7] 国家药典委员会YBH24232005（氨酪酸氯化钠注射液），国家食品药品监管局药品标准（试行）[S].2005.
[8] 王志远.氨酪酸氯化钠注射液的质量研究[J].中国现代医生，2009，47（12）：95-96.
[9] 林芳，郑启敏，吴胜利.氨酪酸氯化钠注射液的质量研究[J].科技风，2010（3）：224.
[10] 刘永久，姚作进.HPLC测定氨酪酸氯化钠注射液中氨酪酸的含量[J].食品与药品，2013，15（3）：189-190.
[11] 施卉，上官盈盈，翁琳，等.注射用氨酪酸的制备与质量控制[J].医药导报，2006，25（8）：810-812.
[12] 周寒，李健和，黎银波，等.氨酪酸氯化钠注射液的研制[J].中南药学，2007，5（6）：511-515.
[13] 陶功意，李健和，万小敏，等.注射用氨酪酸的研制[J].中国药业，2008，17（12）：23-25.
（收稿日期：2014-08-20）
[关键词] 氨酪酸氯化钠注射液；α-吡咯烷酮；含量测定；高效液相色谱法
[中图分类号] R927.1 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2014）22-87-03
氨酪酸（aminobutyric acid）又称γ-氨酪酸、γ-氨基丁酸，是一类氨基酸类抑制性中枢神经递质，在体内可促进葡萄糖磷酸酯酶的激活，从而改善脑细胞功能的恢复，对于脑卒中、动脉硬化症等脑血管疾病及其导致的偏瘫、语言障碍，头部外伤，CO中毒，儿童发育迟缓等具有一定的治疗作用[1-2]。此外，其还可与血氨结合，促进其通过尿液排出，从而降低血氨水平，在肝昏迷的辅助治疗中也广泛应用[3]。目前，临床中使用的剂型多采用氨酪酸氯化钠注射液，然而该品种并未被美国及欧洲药典收载，虽然国家药品标准收载多个质量标[4-7]，但均未完善。近年来，药物监管力度逐渐加强，对于氨酪酸氯化钠注射液的质量要求也逐渐提高，国药典化发[2010]84号文件的发布也要求增加氨酪酸氯化钠注射液中有关物质检查，以防止药物不良反应的发生[8]。目前，对于氨酪酸氯化钠注射液中α-吡咯烷酮的检测研究较少，缺少统一的测定标准。本研究采用高效液相色谱法（HPLC）对氨酪酸氯化钠注射液中α-吡咯烷酮进行检测，旨在为氨酪酸氯化钠注射液中α-吡咯烷酮的检测提供方法标准。
1 仪器与试剂
1.1 仪器
Agilent 1200型高效液相色谱仪：主要包括单元泵、柱温箱、自动进样器、紫外检测器、Agilent色谱工作站及相关检测与分析软件。
1.2 试剂
氨酪酸氯化钠注射液（安徽双鹤药业有限责任公司，批号：20101009、20101011、20101015；山东齐都药业有限公司，批号：10120903）；α-吡咯烷酮（东北制药总厂提供）；甲醇（色谱纯，天津市康科德科技有限公司）；实验用水均为超纯水；磷酸二氢钾、己烷磺酸钠、磷酸等试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱选用CAPCELL PAK C18柱；流动相采用pH 2.1的磷酸二氢钾溶液-甲醇（90∶10），磷酸二氢钾溶液配置流程如下：准确称取磷酸二氢钾10.0g及己烷磺酸钠1.1g，加水稀释，后利用磷酸调整pH为2.1，定容至1000mL；流速维持在1.0mL/min；紫外检测波长设定为210nm；柱温为30℃；进样量为10μL。
2.2 溶液制备及色谱分析
2.2.1 对照品溶液的制备 取α-吡咯烷酮对照品适量，采用蒸馏水溶解并稀释至其浓度约为4μg/mL，作为对照品溶液，备用。
2.2.2 供试品溶液制备 精确移取5mL氨酪酸氯化钠注射液至25mL的量瓶内，蒸馏水稀释至刻度并混匀，备用。
2.2.3 阴性对照溶液制备 准确称取NaCl 0.9g，加水溶解，置入100mL容量瓶，定容，以制备0.9%氯化钠溶液，作为阴性对照溶液使用。
2.2.4 色谱图 对于上述已制备完成的对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各取10μL进样，进行液相色谱分离，记录色谱图。供试品及对照品溶液中α-吡咯烷酮对应峰的保留时间一致，表明HPLC能够有效的分离氨酪酸氯化钠注射液中的α-吡咯烷酮，且阴性对照未出现干扰。
2.3 线性关系试验
分别取对照品溶液1，5，10，15，20μL进样，进行液相色谱分析并记录各自的色谱图，后以α-吡咯烷酮的浓度为X轴，以对应的色谱峰峰面积为Y轴，绘制散点图并行线性回归分析，则有Y=7.052X-0.154，r=0.9998，α-吡咯烷酮浓度为0.4～5.0mg/L时其线性关系良好，可进行α-吡咯烷酮浓度的测定。
2.4 精密度试验
采用对照品溶液进样，连续重复5次，每次进样10μL，记录各自的色谱图，根据各色谱图α-吡咯烷酮对应峰的峰面积计算RSD为0.69%。
2.5 供试品溶液稳定性试验
于0，2，4，6，8，12h分别取供试品溶液10μL进样，行液相色谱分析，并记录各色谱图，测量各不同时间点供试品α-吡咯烷酮对应峰的峰面积，计算峰面积的RSD，结果显示，RSD为0.28%，表明氨酪酸氯化钠注射液在12h内较为稳定。
2.6 重复性试验
取同批次供试品6份，每份取10mL，置于50mL量瓶中，0.9%氯化钠溶液定容至刻度，各取10μL进样进行色谱分离，计算6份溶液中α-吡咯烷酮的含量，结果依次为0.141%、0.140%、0.138%、0.139%、0.140%和0.142%，计算平均含量为0.140%，RSD为1.01%。
2.7 回收率试验
配制已知α-吡咯烷酮浓度的氨酪酸氯化钠溶液，连续取6份，10mL/份，转入50mL量瓶内，后分别加入40.225μg/mLα-吡咯烷酮溶液5ml，采用0.9%的氯化钠溶液稀释至刻度，分别取10μL进样，进行液相色谱分离，记录色谱图，计算会回收率及RSD，如表1所示。结果显示，平均回收率为100.27%，6份样品回收率的RSD为0.54%。 2.8 检出限
检出限测定溶液的配制如下：取适量对照品溶液，使用蒸馏水稀释至α-吡咯烷酮浓度为0.4μg/mL。移取1μL检出限测定溶液进样，行高效液相色谱，以S/N=3计算检出限，结果显示，α-吡咯烷酮的检出限为0.4ng。
2.9 样品测定
采用来自不同厂家、不同批次间的氨酪酸氯化钠注射液作为供试品，制备供试品溶液，分别采用国标法及HPLC法测定样品中α-吡咯烷酮的含量，结果如表2。安徽双鹤药业有限公司的3批样品中α-吡咯烷酮含量分别为0.141%、0.143%、0.140%，山东齐都药业有限公司的1批样品中α-吡咯烷酮含量为0.117%。
3 讨论
氨酪酸（aminobutyric acid）是一种小分子两性氨基酸，作为抑制中枢神经的递质，能够促进脑细胞功能恢复，对于脑血管疾病及后遗症、中毒昏迷等的治疗具有重要作用。目前临床所用多为注射液，不仅有效防止药液暴露，造成微生物、粉尘等的二次污染，同时增加了药物的安全性及便捷性[9]。
对于氨酪酸的制备工艺，经过文献检索和生产要求，主要包括化学水解法和生物酶解法两类，其中，化学水解法主要是在138～142℃高温下利用氢氧化钙水解α-吡咯烷酮所得；生物酶解法主要是通过培养表达4-丁内酰胺水解酶的菌株，利用4-丁内酰胺水解酶对于α-吡咯烷酮的水解作用制的[10-12]。由于两种方法均以α-吡咯烷酮作为底物，在生产过程中往往难以充分将α-吡咯烷酮彻底转化，不可避免的在氨酪酸中存在，然而，作为一种高毒性的化学物质，α-吡咯烷酮的残余，往往会导致不良反应的发生[13]，因此，加强对于氨酪酸氯化钠注射液α-吡咯烷酮的含量检测对于提高药品质量具有重要作用。
本研究中选用CAPCELL PAK C18柱为色谱柱；流动相采用pH 2.1的磷酸二氢钾溶液-甲醇（90∶10）；流速维持在1.0mL/min；检测波长为210nm；柱温为30℃；进样量为10μL，此条件下进行HPLC检测发现，对于α-吡咯烷酮具有较好的分离度，线性关系及回收率均能达到试验要求。其中，对于流动相的选择，采用现行氨酪酸氯化钠注射液质量标准中的流动相进行，未取得理想结果，故采用磷酸二氢钾溶液-甲醇（90∶10）（pH=2.1）进行。此外，采用磷酸二氢钾溶液-甲醇（90∶10）（pH=2.1）流动相溶液制备α-吡咯烷酮对照品溶液，后采用紫外检测在200～400nm的波长范围内扫描，未发现特征吸收，仅在紫外末端区有吸收，且阴性对照无干扰出现，因此，选取210nm作为测定波长。
综上所述，本研究介绍的HPLC法测定氨酪酸氯化钠注射液中的α-吡咯烷酮具有较好的效果，为改善氨酪酸氯化钠注射液的质量标准提供了理论依据。
[参考文献]
[1] 刘艳，徐玉文，李玉梅，等.高效液相色谱法测定氨酪酸氯化钠注射液中的α-吡咯烷酮[J].中国生化药物杂志，2012，33（4）：422-424.
[2] 林谦.γ-氨基丁酸的生理功能概述[J].玉林师范学院学报，2010，31（2）：62-65.
[3] 梁叶.高压氧联合氨酪酸治疗一氧化碳中毒迟发性脑病效果观察[J].中国医疗前沿，2013（17）：34，109.
[4] 国家药典委员会YBH02622006（氨酪酸氯化钠注射液），国家食品药品监管局药品标准（试行）[S].2006.
[5] 国家药典委员会YBH40692005（氨酪酸氯化钠注射液），国家食品药品监管局药品标准（试行）[S].2005.
[6]国家药典委员会YBH33742005（氨酪酸氯化钠注射液），国家食品药品监管局药品标准（试行）[S].2005.
[7] 国家药典委员会YBH24232005（氨酪酸氯化钠注射液），国家食品药品监管局药品标准（试行）[S].2005.
[8] 王志远.氨酪酸氯化钠注射液的质量研究[J].中国现代医生，2009，47（12）：95-96.
[9] 林芳，郑启敏，吴胜利.氨酪酸氯化钠注射液的质量研究[J].科技风，2010（3）：224.
[10] 刘永久，姚作进.HPLC测定氨酪酸氯化钠注射液中氨酪酸的含量[J].食品与药品，2013，15（3）：189-190.
[11] 施卉，上官盈盈，翁琳，等.注射用氨酪酸的制备与质量控制[J].医药导报，2006，25（8）：810-812.
[12] 周寒，李健和，黎银波，等.氨酪酸氯化钠注射液的研制[J].中南药学，2007，5（6）：511-515.
[13] 陶功意，李健和，万小敏，等.注射用氨酪酸的研制[J].中国药业，2008，17（12）：23-25.
（收稿日期：2014-08-20）