【摘 要】
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对核苷二磷酸激酶A(NDPK-A)的异构及其分子机制进行研究.还原和非还原SDS-PAGE观察重组人核苷二磷酸激酶A(rhNDPK-A)的异构;RP-HPLC分析rhNDPK-A异构体的反相色谱行为,并测定
【机 构】
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暨南大学药学院制药工程教研室,广州,510630暨南大学生物医药研究开发基地,广州,510630;暨南大学生物医药研究开发基地,广州,510630;北京凯正生物工程发展有限责任公司,北京,100850
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对核苷二磷酸激酶A(NDPK-A)的异构及其分子机制进行研究.还原和非还原SDS-PAGE观察重组人核苷二磷酸激酶A(rhNDPK-A)的异构;RP-HPLC分析rhNDPK-A异构体的反相色谱行为,并测定rhNDPK-A异构体的酶活性;多角度激光散射法测定rhNDPK-A异构体在溶液中的表观分子量;飞行质谱分析异构体的质量肽谱.结果发现,rhNDPK-A在非还原SDS-PAGE上表现为4条带,对应于NDPK-A的氧化型、还原型、氧化型二聚体和还原型二聚体,其分子量分别为18.1 kD、21.3 kD、35.2 kD和38.3 kD.RP-HPLC发现,还原型rhNDPK-A和氧化型rhNDPK-A疏水性有差异.新鲜制备的rhNDPK-A在纯水溶液中,经空气氧化后,逐渐由还原型向氧化型过渡,而还原剂或生理盐水可使rhNDPK-A稳定于还原型或氧化型.酶活测定结果表明,还原型rhNDPK-A比活性为1965±166U/mg,氧化型rhNDPK-A比活性为974±53 U/mg.多角度激光散射检测发现,还原型rhNDPK-A在溶液中仍可形成六聚体.质量肽谱结果证明,在氧化型rhNDPK-A中,C4和C145位巯基形成二硫键,而C109位巯基游离存在.根据本文所确定的NDPK-A单体中的二硫键位置,推导出rhNDPK-A单体异构体和二聚体异构体的变构原理,这为进一步研究NDPK-A的多能性调节机制打下了良好基础.
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