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摘要：采用室内生物测定的方法，从6种载体、6种分散剂、5种黏着剂、5种紫外保护剂中筛选适宜于顶孢霉Ahy1孢子粉微粉剂的助剂。结果表明，载体硅藻土、紫外线保护剂荧光素钠和腐植酸、分散剂木质素磺酸钠（或钙）、黏着剂羧甲基纤维素对顶孢霉孢子的生物活性无显著影响。用以上助剂加工的20%顶孢霉孢子粉微粉剂，孢子含量为9.8×109个/g，干燥减量为4.36%，孢子萌发率为90.23%，比重为0.37 g/cm3，颗粒细度过200目筛，粉粒直径约为74 μm， 5 ℃下贮藏6个月后孢子萌发率为80%，符合真菌农药粉剂国家标准（标准号GB/T258642010），在微粉细度上符合制剂标准。
关键词：顶孢霉； 孢子粉； 粉剂； 载体； 分散剂； 黏着剂； 紫外保护剂
中图分类号： S 482.39
文献标识码： A
真菌生防制剂是以有害生物的病原真菌为有效成分的生物农药，具有触杀性、流行性、环境安全、不杀伤非目标生物等特点，在病虫草害控制中具有巨大潜力[1]。随着微生物防治的日益发展，病原微生物的生产规模向制剂化及其商业化方向发展[2]。球孢白僵菌的应用在昆虫病原真菌中是比较成功的例子，其剂型从传统的粉剂、油悬浮剂、颗粒剂、可湿性粉剂到安全环保的水基性制剂均有登记注册，利用这些制剂防治农林业害虫也取得了巨大成效[3]。
汉逊顶孢霉（Acremonium hansfordii）是一种虫生真菌[4]。甘肃农业大学农药系从蚜虫上分离获得一株顶孢霉菌株Ahy1。宋丽雯[5]研究证实该菌株对桃蚜、苜蓿斑蚜、豆无网长管蚜、黏虫和菜青虫均有较强的侵染力。开发适宜于甘肃省干旱条件下生产和应用的顶孢霉杀虫制剂，对保护生态环境具有十分重要的意义。甘肃农业大学农药实验室已经筛选的顶孢霉Ahy1菌株分生孢子制剂有可湿性粉剂[6]、乳悬剂[7]。近年来随着有机食品需求越来越大，蔬菜大棚应用越来越广泛，筛选一种更适用于温室大棚环境的顶孢霉分生孢子制剂对温室蔬菜害虫的绿色防控有重要意义。微粉剂以单一粒子在空间悬浮、扩散，可均匀附着在作物上。平均粒径在5 μm以下的细粉剂，其特点是粉剂粒子不凝聚，适用于从室外向温室、大棚内喷粉，且操作简单、迅速、安全。粉粒在空气中的悬浮时间也比同等细度的雾滴长，粉剂在棚室空间能够形成比较持久的粉雾现象。真菌孢子粉形成的粉雾在温室大棚中能够充分扩散，在叶上均匀分布，其效果显著优于喷雾法[8]。本文对顶孢霉Ahy1菌株分生孢子微粉剂配方进行了筛选，旨在为研制顶孢霉新制剂提供依据。
1 材料和方法
1.1 试验材料
菌株及孢子粉：顶孢霉Ahy1菌株及其孢子粉，由甘肃农业大学农药实验室提供。
载体：硅藻土（天津市大茂化学试剂厂）、高岭土（上海建信化工有限公司试剂厂）、白炭黑（天津市大茂化学试剂厂）、碳酸钙、膨润土和滑石粉均由天津市光复精细化工研究所生产。
分散剂：木质素磺酸钙、木质素磺酸钠、聚萘磺酸钠、二丁基萘磺酸钠、月桂酸钠均由天津市光复精细化工研究所提供，辛基酚聚氧乙烯醚磺酸钠（江苏省海安石油化工厂）。
黏着剂：淀粉、聚乙烯醇（苏州利源化工）、聚乙酸乙烯酯（苏州利源化工）、羧甲基纤维素（天津市光复精细化工研究所）、硅酸钠（天津市光复精细化工研究所）。
紫外保护剂：腐植酸（乌海市全圣化工有限责任公司）、荧光素钠（天津市光复精细化工研究所）、糊精（天津市光复精细化工研究所）、抗坏血酸（天津市光复精细化工研究所）、海藻酸钠（分析纯）（山东昊洋海藻工业有限公司）。
1.2 试验方法
1.2.1 载体筛选方法
以5%（W/V）的比例将6种供试载体加入PDA培养基中混匀，灭菌后制成平板。取0.1 mL孢子浓度为103个/mL的顶孢霉孢子悬浮液，涂布在含不同载体的各平板上。以不含载体的PDA平板为对照，每处理设置3个重复，置于恒温培养箱中，（25±1） ℃下培养3 d。观察记录各平板长出的顶孢霉形成的菌落数量，计算1 mL孢子悬浮液形成菌落数（cfu/mL）。
按上述方法制备含各种载体的平板。在培养5 d的菌落边缘生长旺盛的部分，用打孔器（d=5 mm）打取菌块，接种到含各载体的培养基上，每处理设置3个重复，置于恒温培养箱中，（25±1） ℃下培养5 d后，测出菌落直径，计算菌落直径日增长量：
菌落直径日增长量（mm）=菌落直径生长天数
分别取1 g孢子粉与5 g不同载体粉末混匀，置于棕色试剂瓶内，封口后常温贮存，分别于15、30和120 d后取0.5 g混合物加入50 mL马铃薯葡萄糖培养液（PDB）中。在恒温振荡培养箱中，（25±1） ℃下振荡培养24 h，抽样镜检孢子萌发率。
1.2.2 分散剂筛选方法
将供试分散剂按 125、250、500和1 000 μg/mL 4种浓度的比例与融化的PDA培养基混合，灭菌后制成平板。取0.1 mL孢子浓度为103个/mL 的顶孢霉孢子悬浮液，涂布在含不同分散剂的各平板上。以不含分散剂的 PDA 平板为对照。每处理设置3个重复，置于恒温培养箱中，（25±1）℃下培养3 d。观察各平板形成的菌落数量，计算1 mL孢子悬浮液形成菌落数（cfu/mL）。菌落直径增长量的试验方法同1.2.1。
1.2.3 黏着剂的筛选
5种黏着剂对顶孢霉菌丝生长和孢子萌发的影响测定方法同1.2.1。
分别取孢子粉2 g与0.1 g不同载体粉末混匀，置于棕色试剂瓶内，封口后常温贮存，分别于15、30和120 d后取0.2 g混合物加入20 mL马铃薯葡萄糖培养液（PDB）中。在恒温振荡培养箱中，（25±1） ℃下振荡培养24 h，抽样镜检孢子萌发率。 1.2.4 紫外保护剂筛选
取活化培养7 d的新鲜菌株，向培养皿中加入10 mL无菌水洗脱孢子，在显微镜下用血球计数板计数并计算孢子含量，配制成浓度为104个/mL的孢子悬浮液，然后将各种供试紫外保护剂按0.3%的比例加入孢子悬浮液中，混合均匀。用移液器吸取0.1 mL上述孢子悬浮液于无菌盖玻片上，涂抹均匀。然后，将各盖玻片置于紫外灯（功率30 W，光强120 lx）下照射1 min后，将玻片平放在培养皿底部，皿中用湿润的滤纸保湿。将培养皿放在25 ℃下黑暗培养，以免孢子光复活。24 h后，在显微镜下抽样计数萌发孢子数并计算出萌发率。以不加紫外保护剂的顶孢霉孢子悬浮液作照射和不照射的对照处理。
1.2.5 20%顶孢霉Ahy1菌株微粉剂加工及质量检查方法
按照孢子粉含量20%，分散剂5%，紫外保护剂1%的比例加工顶孢霉微粉剂，并对其质量指标进行检测。真菌孢子微粉剂的质量检测主要包含以下指标：含孢量、干燥减量、活孢率、细度和贮存稳定性。
含孢量检测[8]：用万分之一天平称取1 g产品加入100 mL蒸馏水中混匀，用血球计数板计数孢子悬浮液浓度c，计算制剂孢子含量。
制剂孢子含量（个/g）=c×100；
干燥减量检测[8]：用万分之一天平称取10 g产品，置于恒温鼓风干燥箱中，120 ℃下干燥2 h后迅速称其重量W，计算干燥减量。
干燥减量（%）=10-W10×100；
活孢率检测[9]：取少许混合物加入3 mL的营养液中，振荡均匀。加入孢子的浓度以400倍显微镜下，血球计数板每小格4～8个孢子为宜。将菌悬液涂成玻片，（25±1） ℃下培养24 h后，观察计数孢子的萌发率。取不同位置的5个视野，分别观察萌发孢子数与孢子总数，计算萌发率。
活孢率（%）=萌发孢子数孢子总数×100；
微粉细度检测[8]：容积比重测定方法。选取已知容积的塑料瓶，把干燥的测试粉剂样品从光滑的纸上滑入塑料筒中直至药粉溢出筒口，注意药粉不可急速冲入塑料筒中。静置约半分钟，用一把直尺贴近筒口，小心地从筒口平推，把多余的药粉刮去，使筒口的药粉成为平面状态。把筒内的药粉仔细倒出，称出粉剂的质量（g），计算出单位体积的粉剂质量，即得容积比重（g/cm3）。
贮存稳定性检测：5 ℃贮存180 d，每隔15 d检查活孢率。活孢率检测方法同上。
1.2.6 生物活性测定
生物活性的测定采用喷粉法。将田间采集的甘蓝蚜（Brevicoryne brassicae）转至室内盆栽的甘蓝苗上饲养，定殖后选择龄期一致的无翅成蚜，移入铺有甘蓝叶片的培养皿（直径150 mm，底部用海绵和滤纸保湿）中，用浸渍十字花科营养液的消毒棉球包裹叶柄。使用小型塑料喷粉瓶在培养皿上均匀喷粉。每皿30头试虫，重复3次，并设不喷粉的对照。
将喷粉处理的培养皿和对照置于光照培养箱（25 ℃，RH=80%，L∥D=12 h∥12 h）中，自第3天起每天观察一次，记录试虫死亡、存活数目及虫体感病症状。每次检查时将虫尸移出培养皿，根据虫尸表面是否有供试菌长出物而确定感染致死情况，计算死亡率和校正死亡率。
死亡率（%）=死亡虫数供试总虫数×100；
校正死亡率（%）=处理死亡率-对照死亡率1-对照死亡率×100。
2 结果与分析
2.1 载体的选择
高岭土、硅藻土、碳酸钙、膨润土、白炭黑和滑石粉6种载体对顶孢霉菌株Ahy1菌丝生长和孢子萌发的影响测定结果见表1和图1。6种供试载体对顶孢霉菌株Ahy1菌落直径日增长量的影响与对照相比差异显著，碳酸钙、硅藻土和白炭黑与顶孢霉混合后，顶孢霉平均菌落直径日增长量分别为13.58、13.41和13.00 mm，优于高岭土、膨润土和滑石粉；6种供试载体对菌落形成单位数的影响与对照相比差异显著，硅藻土、碳酸钙和膨润土与Ahy1混合后平均菌落形成单位数分别为716.37、700.82和696.77 cfu/mL，显著优于高岭土、白炭黑和滑石粉。6种载体与Ahy1孢子粉混合对其孢子萌发率的影响见图1。储存120 d后对孢子萌发率影响最小的载体是硅藻土和碳酸钙。由于碳酸钙的分子量（100.09）和密度（0.5 g/cm3）均大于硅藻土（分子量60.08，密度0.28 g/cm3），所以选择粒径更细、悬浮性能强的硅藻土作为Ahy1微粉剂的载体。
2.2 分散剂的选择
木质素磺酸钙、木质素磺酸钠、辛基酚聚氧乙烯醚磺酸钠、聚萘磺酸钠、二丁基萘磺酸钠、月桂酸钠6种分散剂对Ahy1菌丝生长和孢子萌发的影响见图2、图3。木质素磺酸钠和木质素磺酸钙在低浓度时对Ahy1菌丝生长和孢子萌发均无明显影响，但在高浓度时对Ahy1菌落直径日增长量和孢子萌发有轻微的抑制作用；其他4种分散剂在低浓度和高浓度时均影响较大。因此选用木质素磺酸钠或木质素磺酸钙作为Ahy1微粉剂的分散剂。
2.3 黏着剂的选择
淀粉、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、羧甲基纤维素、硅酸钠5种黏着剂对顶孢霉菌株Ahy1菌丝生长和孢子萌发的影响测定结果见表2和图4。羧甲基纤维素和淀粉对Ahy1菌丝生长和孢子萌发的影响均不显著，处理后Ahy1平均菌落日增长量分别是13.74和13.23 mm，平均形成菌落数分别是674.91和666.78 cfu/mL；5种分散剂与Ahy1孢子粉混合储存120 d后对孢子萌发率影响最小的是羧甲基纤维素（见图4）。结果表明：羧甲基纤维素可作为Ahy1微粉剂的黏着剂。
2.4 紫外保护剂的选择
腐植酸、荧光素钠、糊精、抗坏血酸、海藻酸钠5种紫外保护剂对顶孢霉菌株Ahy1孢子萌发的影响结果见表3。在紫外灯（功率30 W，光强120 lx）下照射40 s后，5种紫外保护剂处理的Ahy1孢子萌发率与对照差异显著。其中腐植酸和荧光素钠处理后，Ahy1孢子萌发率分别为77.67%和75.67%； 其余3种紫外保护剂处理Ahy1孢子萌发率较低，均在30%以下。结果表明紫外保护剂可选择腐植酸和荧光素钠。 2.5 20%顶孢霉微粉剂加工与质量检测
2.5.1 98亿孢子/g顶孢霉微粉剂配方与加工
以木质素磺酸钠或木质素磺酸钙作分散剂、羧甲基纤维素作黏着剂、荧光素钠作紫外保护剂和孢子粉按照以下比例混合：孢子粉20%，分散剂5%，黏着剂1%，紫外保护剂1%，添加硅藻土填料至100%，用超细粉碎机将各成分混匀，制成98亿孢子/g顶孢霉Ahy1菌株微粉剂（中试产品）。
2.5.2 98亿孢子/g顶孢霉微粉剂的质量检测
通过98亿孢子/g顶孢霉Ahy1微粉剂加工获得的中试产品，质量检测结果为：孢子含量9.8×109个孢子/g，干燥减量4.36%，孢子萌发率90.23%，容积比重0.37 g/cm3，颗粒细度为过200目筛，粉粒直径约74 μm，5 ℃下贮藏6个月后孢子萌发率80%（图5），20%顶孢霉Ahy1微粉剂中试产品基本符合同类粉剂的国家标准（标准号GB/T258642010）[10]。
2.6 98亿孢子/g顶孢霉微粉剂生物活性测定结果
通过对98亿孢子/g顶孢霉Ahy1微粉剂进行生物活性测定，结果表明在第8天时死亡率达到60%（图6）。
3 结论与讨论
载体是微粉剂中的主要成分，对粉剂的质量起着至关重要的作用。特别是对微生物制剂来说，孢子是有效成分，载体的优劣决定着孢子的成活率和贮存时间。试验结果表明，碳酸钙和硅藻土是两种对Ahy1菌株菌落生长量和菌落形成数影响均较小的载体。但从2种载体本身性质及所要研究的剂型特点考虑，硅藻土是较为理想的顶孢霉微粉剂载体。
太阳辐射的紫外线能降低孢子的萌发率，或延缓孢子萌发[11]，因为紫外线有可能造成细胞中DNA分子结构的损伤，特别是胸腺嘧啶二聚体的形成，使DNA复制受阻而导致细胞死亡[12]。对紫外保护剂的筛选结果表明，紫外保护剂效果最好的是腐植酸，其次是荧光素钠。
20%顶孢霉Ahy1微粉剂加工获得的中试产品，孢子含量为9.8×109个孢子/g，干燥减量为4.36%，孢子萌发率为90.23%，颗粒细度为过200目筛，粉粒直径约为74 μm，5 ℃下贮藏6个月后孢子萌发率为80%。与球孢白僵菌粉剂国家标准（标准号GB/T258642010，含孢量（100土10）亿孢子/g，孢子萌发率≥90%，干燥减量≤10%，在5 ℃条件下贮存180 d，孢子萌发率大于80%，细度为高孢粉全部通过160目筛，低孢粉全部通过35目筛）比较，20%顶孢霉Ahy1微粉剂中试产品基本符合低孢粉标准，在颗粒细度上符合微粉剂的要求。
在测定过程中，由于每次检查时将虫尸移出培养皿，减少了继续侵染的机会，导致第8 天以后试虫死亡率不再继续增大。而在田间应用中，由于菌丝体产生的分生孢子能够再次侵染害虫，所以持效期更长。
微生物农药的剂型加工和贮存稳定性一直是制约其发展和应用的重要因素之一[13]。粉剂是微生物农药应用较早的一种剂型，例如白僵菌粉剂用于森林虫害的防治。由于设施农业推广和温室经济作物的种植面积逐渐扩大，设施大棚病虫害发生呈上升趋势，鉴于温室大棚的小气候特别适合微粉剂的微生物杀虫剂，借助于高温高湿，真菌孢子可黏着在虫体上，完成入侵和致病过程，从而达到防治为害设施蔬菜害虫的效果，因此研究顶孢霉微粉剂新剂型，对于顶孢霉菌株在设施经济作物蚜虫等重要害虫的绿色防控具有重要意义。但是微粉剂的稳定性和田间防效还需进一步试验研究。
参考文献
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（责任编辑：田 喆）
关键词：顶孢霉； 孢子粉； 粉剂； 载体； 分散剂； 黏着剂； 紫外保护剂
中图分类号： S 482.39
文献标识码： A
真菌生防制剂是以有害生物的病原真菌为有效成分的生物农药，具有触杀性、流行性、环境安全、不杀伤非目标生物等特点，在病虫草害控制中具有巨大潜力[1]。随着微生物防治的日益发展，病原微生物的生产规模向制剂化及其商业化方向发展[2]。球孢白僵菌的应用在昆虫病原真菌中是比较成功的例子，其剂型从传统的粉剂、油悬浮剂、颗粒剂、可湿性粉剂到安全环保的水基性制剂均有登记注册，利用这些制剂防治农林业害虫也取得了巨大成效[3]。
汉逊顶孢霉（Acremonium hansfordii）是一种虫生真菌[4]。甘肃农业大学农药系从蚜虫上分离获得一株顶孢霉菌株Ahy1。宋丽雯[5]研究证实该菌株对桃蚜、苜蓿斑蚜、豆无网长管蚜、黏虫和菜青虫均有较强的侵染力。开发适宜于甘肃省干旱条件下生产和应用的顶孢霉杀虫制剂，对保护生态环境具有十分重要的意义。甘肃农业大学农药实验室已经筛选的顶孢霉Ahy1菌株分生孢子制剂有可湿性粉剂[6]、乳悬剂[7]。近年来随着有机食品需求越来越大，蔬菜大棚应用越来越广泛，筛选一种更适用于温室大棚环境的顶孢霉分生孢子制剂对温室蔬菜害虫的绿色防控有重要意义。微粉剂以单一粒子在空间悬浮、扩散，可均匀附着在作物上。平均粒径在5 μm以下的细粉剂，其特点是粉剂粒子不凝聚，适用于从室外向温室、大棚内喷粉，且操作简单、迅速、安全。粉粒在空气中的悬浮时间也比同等细度的雾滴长，粉剂在棚室空间能够形成比较持久的粉雾现象。真菌孢子粉形成的粉雾在温室大棚中能够充分扩散，在叶上均匀分布，其效果显著优于喷雾法[8]。本文对顶孢霉Ahy1菌株分生孢子微粉剂配方进行了筛选，旨在为研制顶孢霉新制剂提供依据。
1 材料和方法
1.1 试验材料
菌株及孢子粉：顶孢霉Ahy1菌株及其孢子粉，由甘肃农业大学农药实验室提供。
载体：硅藻土（天津市大茂化学试剂厂）、高岭土（上海建信化工有限公司试剂厂）、白炭黑（天津市大茂化学试剂厂）、碳酸钙、膨润土和滑石粉均由天津市光复精细化工研究所生产。
分散剂：木质素磺酸钙、木质素磺酸钠、聚萘磺酸钠、二丁基萘磺酸钠、月桂酸钠均由天津市光复精细化工研究所提供，辛基酚聚氧乙烯醚磺酸钠（江苏省海安石油化工厂）。
黏着剂：淀粉、聚乙烯醇（苏州利源化工）、聚乙酸乙烯酯（苏州利源化工）、羧甲基纤维素（天津市光复精细化工研究所）、硅酸钠（天津市光复精细化工研究所）。
紫外保护剂：腐植酸（乌海市全圣化工有限责任公司）、荧光素钠（天津市光复精细化工研究所）、糊精（天津市光复精细化工研究所）、抗坏血酸（天津市光复精细化工研究所）、海藻酸钠（分析纯）（山东昊洋海藻工业有限公司）。
1.2 试验方法
1.2.1 载体筛选方法
以5%（W/V）的比例将6种供试载体加入PDA培养基中混匀，灭菌后制成平板。取0.1 mL孢子浓度为103个/mL的顶孢霉孢子悬浮液，涂布在含不同载体的各平板上。以不含载体的PDA平板为对照，每处理设置3个重复，置于恒温培养箱中，（25±1） ℃下培养3 d。观察记录各平板长出的顶孢霉形成的菌落数量，计算1 mL孢子悬浮液形成菌落数（cfu/mL）。
按上述方法制备含各种载体的平板。在培养5 d的菌落边缘生长旺盛的部分，用打孔器（d=5 mm）打取菌块，接种到含各载体的培养基上，每处理设置3个重复，置于恒温培养箱中，（25±1） ℃下培养5 d后，测出菌落直径，计算菌落直径日增长量：
菌落直径日增长量（mm）=菌落直径生长天数
分别取1 g孢子粉与5 g不同载体粉末混匀，置于棕色试剂瓶内，封口后常温贮存，分别于15、30和120 d后取0.5 g混合物加入50 mL马铃薯葡萄糖培养液（PDB）中。在恒温振荡培养箱中，（25±1） ℃下振荡培养24 h，抽样镜检孢子萌发率。
1.2.2 分散剂筛选方法
将供试分散剂按 125、250、500和1 000 μg/mL 4种浓度的比例与融化的PDA培养基混合，灭菌后制成平板。取0.1 mL孢子浓度为103个/mL 的顶孢霉孢子悬浮液，涂布在含不同分散剂的各平板上。以不含分散剂的 PDA 平板为对照。每处理设置3个重复，置于恒温培养箱中，（25±1）℃下培养3 d。观察各平板形成的菌落数量，计算1 mL孢子悬浮液形成菌落数（cfu/mL）。菌落直径增长量的试验方法同1.2.1。
1.2.3 黏着剂的筛选
5种黏着剂对顶孢霉菌丝生长和孢子萌发的影响测定方法同1.2.1。
分别取孢子粉2 g与0.1 g不同载体粉末混匀，置于棕色试剂瓶内，封口后常温贮存，分别于15、30和120 d后取0.2 g混合物加入20 mL马铃薯葡萄糖培养液（PDB）中。在恒温振荡培养箱中，（25±1） ℃下振荡培养24 h，抽样镜检孢子萌发率。 1.2.4 紫外保护剂筛选
取活化培养7 d的新鲜菌株，向培养皿中加入10 mL无菌水洗脱孢子，在显微镜下用血球计数板计数并计算孢子含量，配制成浓度为104个/mL的孢子悬浮液，然后将各种供试紫外保护剂按0.3%的比例加入孢子悬浮液中，混合均匀。用移液器吸取0.1 mL上述孢子悬浮液于无菌盖玻片上，涂抹均匀。然后，将各盖玻片置于紫外灯（功率30 W，光强120 lx）下照射1 min后，将玻片平放在培养皿底部，皿中用湿润的滤纸保湿。将培养皿放在25 ℃下黑暗培养，以免孢子光复活。24 h后，在显微镜下抽样计数萌发孢子数并计算出萌发率。以不加紫外保护剂的顶孢霉孢子悬浮液作照射和不照射的对照处理。
1.2.5 20%顶孢霉Ahy1菌株微粉剂加工及质量检查方法
按照孢子粉含量20%，分散剂5%，紫外保护剂1%的比例加工顶孢霉微粉剂，并对其质量指标进行检测。真菌孢子微粉剂的质量检测主要包含以下指标：含孢量、干燥减量、活孢率、细度和贮存稳定性。
含孢量检测[8]：用万分之一天平称取1 g产品加入100 mL蒸馏水中混匀，用血球计数板计数孢子悬浮液浓度c，计算制剂孢子含量。
制剂孢子含量（个/g）=c×100；
干燥减量检测[8]：用万分之一天平称取10 g产品，置于恒温鼓风干燥箱中，120 ℃下干燥2 h后迅速称其重量W，计算干燥减量。
干燥减量（%）=10-W10×100；
活孢率检测[9]：取少许混合物加入3 mL的营养液中，振荡均匀。加入孢子的浓度以400倍显微镜下，血球计数板每小格4～8个孢子为宜。将菌悬液涂成玻片，（25±1） ℃下培养24 h后，观察计数孢子的萌发率。取不同位置的5个视野，分别观察萌发孢子数与孢子总数，计算萌发率。
活孢率（%）=萌发孢子数孢子总数×100；
微粉细度检测[8]：容积比重测定方法。选取已知容积的塑料瓶，把干燥的测试粉剂样品从光滑的纸上滑入塑料筒中直至药粉溢出筒口，注意药粉不可急速冲入塑料筒中。静置约半分钟，用一把直尺贴近筒口，小心地从筒口平推，把多余的药粉刮去，使筒口的药粉成为平面状态。把筒内的药粉仔细倒出，称出粉剂的质量（g），计算出单位体积的粉剂质量，即得容积比重（g/cm3）。
贮存稳定性检测：5 ℃贮存180 d，每隔15 d检查活孢率。活孢率检测方法同上。
1.2.6 生物活性测定
生物活性的测定采用喷粉法。将田间采集的甘蓝蚜（Brevicoryne brassicae）转至室内盆栽的甘蓝苗上饲养，定殖后选择龄期一致的无翅成蚜，移入铺有甘蓝叶片的培养皿（直径150 mm，底部用海绵和滤纸保湿）中，用浸渍十字花科营养液的消毒棉球包裹叶柄。使用小型塑料喷粉瓶在培养皿上均匀喷粉。每皿30头试虫，重复3次，并设不喷粉的对照。
将喷粉处理的培养皿和对照置于光照培养箱（25 ℃，RH=80%，L∥D=12 h∥12 h）中，自第3天起每天观察一次，记录试虫死亡、存活数目及虫体感病症状。每次检查时将虫尸移出培养皿，根据虫尸表面是否有供试菌长出物而确定感染致死情况，计算死亡率和校正死亡率。
死亡率（%）=死亡虫数供试总虫数×100；
校正死亡率（%）=处理死亡率-对照死亡率1-对照死亡率×100。
2 结果与分析
2.1 载体的选择
高岭土、硅藻土、碳酸钙、膨润土、白炭黑和滑石粉6种载体对顶孢霉菌株Ahy1菌丝生长和孢子萌发的影响测定结果见表1和图1。6种供试载体对顶孢霉菌株Ahy1菌落直径日增长量的影响与对照相比差异显著，碳酸钙、硅藻土和白炭黑与顶孢霉混合后，顶孢霉平均菌落直径日增长量分别为13.58、13.41和13.00 mm，优于高岭土、膨润土和滑石粉；6种供试载体对菌落形成单位数的影响与对照相比差异显著，硅藻土、碳酸钙和膨润土与Ahy1混合后平均菌落形成单位数分别为716.37、700.82和696.77 cfu/mL，显著优于高岭土、白炭黑和滑石粉。6种载体与Ahy1孢子粉混合对其孢子萌发率的影响见图1。储存120 d后对孢子萌发率影响最小的载体是硅藻土和碳酸钙。由于碳酸钙的分子量（100.09）和密度（0.5 g/cm3）均大于硅藻土（分子量60.08，密度0.28 g/cm3），所以选择粒径更细、悬浮性能强的硅藻土作为Ahy1微粉剂的载体。
2.2 分散剂的选择
木质素磺酸钙、木质素磺酸钠、辛基酚聚氧乙烯醚磺酸钠、聚萘磺酸钠、二丁基萘磺酸钠、月桂酸钠6种分散剂对Ahy1菌丝生长和孢子萌发的影响见图2、图3。木质素磺酸钠和木质素磺酸钙在低浓度时对Ahy1菌丝生长和孢子萌发均无明显影响，但在高浓度时对Ahy1菌落直径日增长量和孢子萌发有轻微的抑制作用；其他4种分散剂在低浓度和高浓度时均影响较大。因此选用木质素磺酸钠或木质素磺酸钙作为Ahy1微粉剂的分散剂。
2.3 黏着剂的选择
淀粉、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、羧甲基纤维素、硅酸钠5种黏着剂对顶孢霉菌株Ahy1菌丝生长和孢子萌发的影响测定结果见表2和图4。羧甲基纤维素和淀粉对Ahy1菌丝生长和孢子萌发的影响均不显著，处理后Ahy1平均菌落日增长量分别是13.74和13.23 mm，平均形成菌落数分别是674.91和666.78 cfu/mL；5种分散剂与Ahy1孢子粉混合储存120 d后对孢子萌发率影响最小的是羧甲基纤维素（见图4）。结果表明：羧甲基纤维素可作为Ahy1微粉剂的黏着剂。
2.4 紫外保护剂的选择
腐植酸、荧光素钠、糊精、抗坏血酸、海藻酸钠5种紫外保护剂对顶孢霉菌株Ahy1孢子萌发的影响结果见表3。在紫外灯（功率30 W，光强120 lx）下照射40 s后，5种紫外保护剂处理的Ahy1孢子萌发率与对照差异显著。其中腐植酸和荧光素钠处理后，Ahy1孢子萌发率分别为77.67%和75.67%； 其余3种紫外保护剂处理Ahy1孢子萌发率较低，均在30%以下。结果表明紫外保护剂可选择腐植酸和荧光素钠。 2.5 20%顶孢霉微粉剂加工与质量检测
2.5.1 98亿孢子/g顶孢霉微粉剂配方与加工
以木质素磺酸钠或木质素磺酸钙作分散剂、羧甲基纤维素作黏着剂、荧光素钠作紫外保护剂和孢子粉按照以下比例混合：孢子粉20%，分散剂5%，黏着剂1%，紫外保护剂1%，添加硅藻土填料至100%，用超细粉碎机将各成分混匀，制成98亿孢子/g顶孢霉Ahy1菌株微粉剂（中试产品）。
2.5.2 98亿孢子/g顶孢霉微粉剂的质量检测
通过98亿孢子/g顶孢霉Ahy1微粉剂加工获得的中试产品，质量检测结果为：孢子含量9.8×109个孢子/g，干燥减量4.36%，孢子萌发率90.23%，容积比重0.37 g/cm3，颗粒细度为过200目筛，粉粒直径约74 μm，5 ℃下贮藏6个月后孢子萌发率80%（图5），20%顶孢霉Ahy1微粉剂中试产品基本符合同类粉剂的国家标准（标准号GB/T258642010）[10]。
2.6 98亿孢子/g顶孢霉微粉剂生物活性测定结果
通过对98亿孢子/g顶孢霉Ahy1微粉剂进行生物活性测定，结果表明在第8天时死亡率达到60%（图6）。
3 结论与讨论
载体是微粉剂中的主要成分，对粉剂的质量起着至关重要的作用。特别是对微生物制剂来说，孢子是有效成分，载体的优劣决定着孢子的成活率和贮存时间。试验结果表明，碳酸钙和硅藻土是两种对Ahy1菌株菌落生长量和菌落形成数影响均较小的载体。但从2种载体本身性质及所要研究的剂型特点考虑，硅藻土是较为理想的顶孢霉微粉剂载体。
太阳辐射的紫外线能降低孢子的萌发率，或延缓孢子萌发[11]，因为紫外线有可能造成细胞中DNA分子结构的损伤，特别是胸腺嘧啶二聚体的形成，使DNA复制受阻而导致细胞死亡[12]。对紫外保护剂的筛选结果表明，紫外保护剂效果最好的是腐植酸，其次是荧光素钠。
20%顶孢霉Ahy1微粉剂加工获得的中试产品，孢子含量为9.8×109个孢子/g，干燥减量为4.36%，孢子萌发率为90.23%，颗粒细度为过200目筛，粉粒直径约为74 μm，5 ℃下贮藏6个月后孢子萌发率为80%。与球孢白僵菌粉剂国家标准（标准号GB/T258642010，含孢量（100土10）亿孢子/g，孢子萌发率≥90%，干燥减量≤10%，在5 ℃条件下贮存180 d，孢子萌发率大于80%，细度为高孢粉全部通过160目筛，低孢粉全部通过35目筛）比较，20%顶孢霉Ahy1微粉剂中试产品基本符合低孢粉标准，在颗粒细度上符合微粉剂的要求。
在测定过程中，由于每次检查时将虫尸移出培养皿，减少了继续侵染的机会，导致第8 天以后试虫死亡率不再继续增大。而在田间应用中，由于菌丝体产生的分生孢子能够再次侵染害虫，所以持效期更长。
微生物农药的剂型加工和贮存稳定性一直是制约其发展和应用的重要因素之一[13]。粉剂是微生物农药应用较早的一种剂型，例如白僵菌粉剂用于森林虫害的防治。由于设施农业推广和温室经济作物的种植面积逐渐扩大，设施大棚病虫害发生呈上升趋势，鉴于温室大棚的小气候特别适合微粉剂的微生物杀虫剂，借助于高温高湿，真菌孢子可黏着在虫体上，完成入侵和致病过程，从而达到防治为害设施蔬菜害虫的效果，因此研究顶孢霉微粉剂新剂型，对于顶孢霉菌株在设施经济作物蚜虫等重要害虫的绿色防控具有重要意义。但是微粉剂的稳定性和田间防效还需进一步试验研究。
参考文献
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（责任编辑：田 喆）