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目的 筛选和鉴定与东方田鼠抗性基因整合素连接激酶相关丝氨酸/苏氨酸磷酸酶(ILKAP)表达蛋白相互结合的日本血吸虫童虫蛋白. 方法 提取东方田鼠骨髓细胞蛋白和日本血吸虫童虫蛋白,进行免疫共沉淀,实验组为东方田鼠骨髓蛋白+日本血吸虫童虫蛋白+ILKAP抗体+磁性珠子,阴性对照组以兔IgG抗体代替ILKAP抗体,阳性对照组为东方田鼠骨髓蛋白或日本血吸虫童虫蛋白.十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对免疫沉淀复合物进行分离,切取差异性蛋白条带通过基质辅助激光解吸飞行时间质谱仪(MALDI-TOF-MS)鉴定,获得的混合物肽片段利用Mascot软件进行分析检索.分别以东方田鼠骨髓cDNA和日本血吸虫童虫cDNA为模板,RT-PCR扩增东方田鼠ILKAP(MfILKAP)基因和日本血吸虫表膜抗原(SjTA)基因.将MfILKAP和SjTA基因分别克隆至真核表达载体Flag-pCMV-2b和Myc-pcDNA3.1/(-)b中,构建的重组质粒Flag-ILKAP-pCMV-2b和Myc-TA-pcDNA3.1/(-)b共转染至HEK293T细胞中作为实验组,设阴性对照组Myc-TA-pcDNA3.1/(-)b或Flag-ILKAP-pCMV-2b和空白对照组Myc-pcDNA3.1/(-)b或Flag-pCMV-2b.用抗体Myc、Flag以及ILKAP分别与转染后的HEK293T细胞总蛋白进行免疫共沉淀和蛋白质印迹(Western blotting)分析. 结果 东方田鼠骨髓细胞蛋白和日本血吸虫童虫蛋白经过免疫共沉淀实验,结果显示,实验组与阴性对照组、阳性对照组相比,有差异条带.经MAIDI-TOF-MS鉴定,利用Mascot软件中的串级质谱数据搜索功能进行搜索鉴定,鉴定出与东方田鼠ILKAP抗体相互作用的日本血吸虫童虫蛋白8种.RT-PCR结果显示,ILKAP和TA在东方田鼠骨髓和日本血吸虫童虫中均有表达,东方田鼠骨髓ILKAP的扩增产物为1 100～～1 200 bp,理论值为1 147 bp,日本血吸虫童虫TA基因的扩增产物大小为500～600 bp,理论值为561 bp.质粒pCMV-Tag 2b、pcDNA3.1/myc-His(-)b经酶切后,均有单一条带,分别约为4 300、5 500 bp;重组质粒Flag-ILKAP-pCMV-2b经酶切鉴定后,其大小分别为4 300和1 147 bp,Myc-TA-pcDNA3.1/(-)b经酶切鉴定后,其大小分别为5 500和561 bp.Western blotting分析结果显示,两种重组真核表达载体共转染实验组的PVDF膜分别与Myc、Flag以及ILKAP抗体孵育后有条带出现,而其他对照组无条带出现. 结论 鉴定出与MfILKAP抗体相互作用的日本血吸虫童虫蛋白8种,在HEK293T细胞中共表达了与MfILKAP结合的SjTA基因,MfILKAP与SjTA之间存在直接相互作用.