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摘要：目的：本研究探讨生物大分子的测定方法及荧光光谱法在其测定中的应用。方法：选用非甾体药物阿司匹林和DNA作为研究对象，采用荧光光谱法研究两者间的相互作用及其类型。结果：阿司匹林与生物大分子DNA间存在强烈的静态猝火作用，猝灭常数和结合位点数分别为K=5.42×105L·mol—1，n=1.485；两者间的相互作用主要通过疏水力共和氢键的非共价键的共作用的沟槽结合。结论：荧光光谱法可以应用于非甾体药物与DNA等生物大分子相互作用的研究，能作为DNA类药物的作用机制研究思路和方法。
关键词：荧光光谱法；生物大分子；相互作用
中图分类号：Q503 文献标识码：A 文章编号：1674—0432（2012）—08—0059—2
研究药物与生物大分子间的相互作用，对于有助于阐明药物在生物体内的运输和代谢机制、药物的毒理机制和临床应用都具有非常重要的参考价值[1]。以往研究药物与生物大分子间相互作用常采用高效液相色谱、核磁共振、毛细管电泳法、电化学法等方法[2]。光谱法是基于物质与辐射能作用时，测量由物质内部发生量子化的能级之间的跃迁而产生的发射、吸收或散射辐射的波长和强度进行分析的方法。光谱法可分为原子光谱法和荧光分子光谱法。本研究选用非甾体药物阿司匹林和DNA作为研究对象，采用FS研究两者间的相互作用，以期为FS的应用以及药物与生物大分子间的相互作用的研究提供新的思路、方法和理论参考。现将研究结果报告如下：
1 材料与方法
1.1 实验试剂
本研究主要的试剂为：阿司匹林（1×10—3mol/L）；DNA—脱氧核糖核酸（1×10—3mol/L）；盐酸—硼砂缓冲溶液（pH=7.20），超纯水等。
1.2 主要仪器
荧光分光光度计—970CRT（杭州汇尔仪器设备有限公司）；Cary 100/300紫外可见分光光度计（美国安捷伦公司）；pH 7200实验室台式PH/mV测试仪（德国）。
1.3 实验方法
依次将阿司匹林溶液和适量的DNA溶液加入10mL比色管中，用盐酸—硼砂缓冲（PH=7.20）溶液摇匀、定容，在室温下放置5—10min后测定荧光光谱。其中荧光激发波长为200nm，记录波长为291nm，荧光发射波长和激发波长狭缝宽度均为5nm。
2 结果
2.1 DNA对阿司匹林的荧光猝灭
分子与分子之间相互作用常会出现荧光猝灭，猝火会导致荧光强度变化，相关的激发峰位变化，荧光峰位变化。因此在研究分子间的相互作用时常通过分子间荧光猝火光谱的变化来研究和确定彼此间是否存在相互作用。本研究中DNA对阿司匹林的荧光猝火光谱见，图（1）。图结果显示：阿司匹林的最大激发波长为200 nm。当保持阿司匹林浓度（1.0u mol/l）不变的情况下，不断加大DNA的浓度，结果发现阿司匹林最大发射波长在291nm时无明显变化，峰值保持不变，而荧光峰发射峰强度逐渐减小。这表明阿司匹林与生物大分子DNA之间存在强烈的相互作用（猝灭作用）。
2.2 DNA对阿司匹林的猝灭常数和结合位点数
药物与生物大分子间的猝灭作用有动态和静态两种，因此在确定猝灭常数和结合位点数时首先必须确定猝灭的种类。研究已经证实静态猝灭符合公式：
log[（F0—F）/F]=logK+nlog[C] （Stern—Volmer公式） [3]。F0和F分别为加人DNA前后阿司匹林的荧光强度，K为阿司匹林与DNA的结合常数、[C]阿司匹林平衡时的浓度、n为结合位点数。以log[（F0—F）/F]/log[C]值做图，图结果如2所示。通过实验数据我们计算出Stern—Volmer方程拟合度R2达到0.987，表明DNA对阿司匹林的猝灭为静态猝灭，进一步计算曲线的截距和斜率等，求得DNA对阿司匹林的猝灭常数和结合位点数分别为K=5.42×105L·mol—1，n=1.485。
2.3 DNA与阿司匹林的相互作用类型
前人已经研究证实，分子间的相互作用主要包括：氢键、静电引力、范德华力等。其中以非共价键结合的方式又包含沟槽结合、表面结合以及嵌插作用3种模式[4]。前面我们研究已经发现DNA与阿司匹林间存在强烈的相互作用，但属于何种作用类型尚不清楚。本研究利用紫外分光光度法对其作用类型进行研究，结果如图3所示：在盐酸—硼砂缓冲溶液（pH=7.20）中，阿司匹林在波长为242nm时，出现其特殊的紫外吸收峰。当逐步加入DNA后并未出现新的紫外吸收峰，但出现了增色效应，阿司匹林的吸收峰位置从242nm处移动至245处，这表明加入DNA后改变了阿司匹林的化学环境和分子结构，结合方式主要通过疏水力共和氢键的非共价键的共作用的沟槽结合。
图3 DNA与阿司匹林结合后紫外光谱
注：1为DNA与阿司匹林结合的曲线；2为阿司匹林单独的曲线
3 讨论
药物与分子间的相互作用研究是药物学、生物化学、药物代谢动力学以及临床医学等学科重要的研究课题。药物作用于生物体往往是通过药物中有效的分子与生物体内相关的生物大分子相互作用，而起到治疗的效果。核酸是生物基本遗传物质，与生物生长、发育及癌变、突变等异常活动相关；药物等分子对人体产生作用，往往最终是通过作用与核酸这样的生物大分子而起作用，因此研究药物分子与生物大分子间的相互作用对于疾病的治疗以及药物的疗效都具有重要的参考意义，已成为当前分析化学研究的前沿热点之一[5]。近年来荧光光谱法（Fluorescence spectroscopy，FS）简便、快速、选择性好、灵敏度高等优点逐渐应用于分子相互作用的研究中，并取得显著成效[6]。本研究选用非甾体药物阿司匹林和DNA作为研究对象，采用荧光光谱法研究两者间的相互作用，快速、准确确定了两者间存在强烈的相互作用（猝灭作用），且确定其猝火类型为静态猝火；通过Stern—Volmer公式计算出阿司匹林和DNA间猝灭常数和结合位点数分别为K=5.42×105L·mol—1，n=1.485。进一步利用紫外—可见光分光光度法，确定了阿司匹林和DNA结合方式主要通过疏水力共和氢键的非共价键的共作用的沟槽结合。综合上述我们认为荧光光谱法可以应用于非甾体药物与DNA等生物大分子相互作用的研究，能作为DNA类药物的作用机制研究思路和方法。
参考文献
[1] 武小芬，蔡朝霞，孙术国等.荧光光谱法研究核黄素与核黄素结合蛋白的相互作用[J].光谱学与光谱分析，2012，3（32）：719—722.
[2] 李杉杉，何华，陈喆等.荧光光谱法研究碳纳米管与牛血清白蛋白间相互作用[J].光谱学与光谱分析， 2010，10（30）：2689—2692.
[3] 陈国珍，黄贤智，郑朱梓等.荧光分析法[M].北京：科学出版社，1990，122.
[4] 于岚岚，杨冉，陈晓英等.光谱法研究喜树碱与牛血清白蛋白的相互作用[J].分析试验室，2012，1（31）：42—46.
[5] 马萍，迟燕华，庄稼等.人血清白蛋白与酸性铬兰K相互作用机理的光谱学[J].应用化学，2008，25（9）：1032—1036.
[6] Yoshinori M Egg Bioscience and Biotechnology[M].New York：John Wiley & Sons Incoporated，2008，141.
作者简介：田玮（1955—），男，汉族，呼和浩特职业学院实验师，从事化学教学工作。
关键词：荧光光谱法；生物大分子；相互作用
中图分类号：Q503 文献标识码：A 文章编号：1674—0432（2012）—08—0059—2
研究药物与生物大分子间的相互作用，对于有助于阐明药物在生物体内的运输和代谢机制、药物的毒理机制和临床应用都具有非常重要的参考价值[1]。以往研究药物与生物大分子间相互作用常采用高效液相色谱、核磁共振、毛细管电泳法、电化学法等方法[2]。光谱法是基于物质与辐射能作用时，测量由物质内部发生量子化的能级之间的跃迁而产生的发射、吸收或散射辐射的波长和强度进行分析的方法。光谱法可分为原子光谱法和荧光分子光谱法。本研究选用非甾体药物阿司匹林和DNA作为研究对象，采用FS研究两者间的相互作用，以期为FS的应用以及药物与生物大分子间的相互作用的研究提供新的思路、方法和理论参考。现将研究结果报告如下：
1 材料与方法
1.1 实验试剂
本研究主要的试剂为：阿司匹林（1×10—3mol/L）；DNA—脱氧核糖核酸（1×10—3mol/L）；盐酸—硼砂缓冲溶液（pH=7.20），超纯水等。
1.2 主要仪器
荧光分光光度计—970CRT（杭州汇尔仪器设备有限公司）；Cary 100/300紫外可见分光光度计（美国安捷伦公司）；pH 7200实验室台式PH/mV测试仪（德国）。
1.3 实验方法
依次将阿司匹林溶液和适量的DNA溶液加入10mL比色管中，用盐酸—硼砂缓冲（PH=7.20）溶液摇匀、定容，在室温下放置5—10min后测定荧光光谱。其中荧光激发波长为200nm，记录波长为291nm，荧光发射波长和激发波长狭缝宽度均为5nm。
2 结果
2.1 DNA对阿司匹林的荧光猝灭
分子与分子之间相互作用常会出现荧光猝灭，猝火会导致荧光强度变化，相关的激发峰位变化，荧光峰位变化。因此在研究分子间的相互作用时常通过分子间荧光猝火光谱的变化来研究和确定彼此间是否存在相互作用。本研究中DNA对阿司匹林的荧光猝火光谱见，图（1）。图结果显示：阿司匹林的最大激发波长为200 nm。当保持阿司匹林浓度（1.0u mol/l）不变的情况下，不断加大DNA的浓度，结果发现阿司匹林最大发射波长在291nm时无明显变化，峰值保持不变，而荧光峰发射峰强度逐渐减小。这表明阿司匹林与生物大分子DNA之间存在强烈的相互作用（猝灭作用）。
2.2 DNA对阿司匹林的猝灭常数和结合位点数
药物与生物大分子间的猝灭作用有动态和静态两种，因此在确定猝灭常数和结合位点数时首先必须确定猝灭的种类。研究已经证实静态猝灭符合公式：
log[（F0—F）/F]=logK+nlog[C] （Stern—Volmer公式） [3]。F0和F分别为加人DNA前后阿司匹林的荧光强度，K为阿司匹林与DNA的结合常数、[C]阿司匹林平衡时的浓度、n为结合位点数。以log[（F0—F）/F]/log[C]值做图，图结果如2所示。通过实验数据我们计算出Stern—Volmer方程拟合度R2达到0.987，表明DNA对阿司匹林的猝灭为静态猝灭，进一步计算曲线的截距和斜率等，求得DNA对阿司匹林的猝灭常数和结合位点数分别为K=5.42×105L·mol—1，n=1.485。
2.3 DNA与阿司匹林的相互作用类型
前人已经研究证实，分子间的相互作用主要包括：氢键、静电引力、范德华力等。其中以非共价键结合的方式又包含沟槽结合、表面结合以及嵌插作用3种模式[4]。前面我们研究已经发现DNA与阿司匹林间存在强烈的相互作用，但属于何种作用类型尚不清楚。本研究利用紫外分光光度法对其作用类型进行研究，结果如图3所示：在盐酸—硼砂缓冲溶液（pH=7.20）中，阿司匹林在波长为242nm时，出现其特殊的紫外吸收峰。当逐步加入DNA后并未出现新的紫外吸收峰，但出现了增色效应，阿司匹林的吸收峰位置从242nm处移动至245处，这表明加入DNA后改变了阿司匹林的化学环境和分子结构，结合方式主要通过疏水力共和氢键的非共价键的共作用的沟槽结合。
图3 DNA与阿司匹林结合后紫外光谱
注：1为DNA与阿司匹林结合的曲线；2为阿司匹林单独的曲线
3 讨论
药物与分子间的相互作用研究是药物学、生物化学、药物代谢动力学以及临床医学等学科重要的研究课题。药物作用于生物体往往是通过药物中有效的分子与生物体内相关的生物大分子相互作用，而起到治疗的效果。核酸是生物基本遗传物质，与生物生长、发育及癌变、突变等异常活动相关；药物等分子对人体产生作用，往往最终是通过作用与核酸这样的生物大分子而起作用，因此研究药物分子与生物大分子间的相互作用对于疾病的治疗以及药物的疗效都具有重要的参考意义，已成为当前分析化学研究的前沿热点之一[5]。近年来荧光光谱法（Fluorescence spectroscopy，FS）简便、快速、选择性好、灵敏度高等优点逐渐应用于分子相互作用的研究中，并取得显著成效[6]。本研究选用非甾体药物阿司匹林和DNA作为研究对象，采用荧光光谱法研究两者间的相互作用，快速、准确确定了两者间存在强烈的相互作用（猝灭作用），且确定其猝火类型为静态猝火；通过Stern—Volmer公式计算出阿司匹林和DNA间猝灭常数和结合位点数分别为K=5.42×105L·mol—1，n=1.485。进一步利用紫外—可见光分光光度法，确定了阿司匹林和DNA结合方式主要通过疏水力共和氢键的非共价键的共作用的沟槽结合。综合上述我们认为荧光光谱法可以应用于非甾体药物与DNA等生物大分子相互作用的研究，能作为DNA类药物的作用机制研究思路和方法。
参考文献
[1] 武小芬，蔡朝霞，孙术国等.荧光光谱法研究核黄素与核黄素结合蛋白的相互作用[J].光谱学与光谱分析，2012，3（32）：719—722.
[2] 李杉杉，何华，陈喆等.荧光光谱法研究碳纳米管与牛血清白蛋白间相互作用[J].光谱学与光谱分析， 2010，10（30）：2689—2692.
[3] 陈国珍，黄贤智，郑朱梓等.荧光分析法[M].北京：科学出版社，1990，122.
[4] 于岚岚，杨冉，陈晓英等.光谱法研究喜树碱与牛血清白蛋白的相互作用[J].分析试验室，2012，1（31）：42—46.
[5] 马萍，迟燕华，庄稼等.人血清白蛋白与酸性铬兰K相互作用机理的光谱学[J].应用化学，2008，25（9）：1032—1036.
[6] Yoshinori M Egg Bioscience and Biotechnology[M].New York：John Wiley & Sons Incoporated，2008，141.
作者简介：田玮（1955—），男，汉族，呼和浩特职业学院实验师，从事化学教学工作。