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摘要[目的] 研究ARTP对脱落酸产生菌的诱变效应及有效性，以期获得高产突变菌株。[方法] 应用ARTP在电源功率100 W、等离子体温度25 ℃、气流量10 SLM、照射距离2 mm的条件下，进行不同照射时间的诱变处理，统计致死率、正变率、变异幅度等。[结果] 在100 s的处理剂量下，ARTP对脱落酸产生菌的正变率在20%以上，诱变幅度在-30.53%～22.06%，高产突变株6-2的S-ABA产量比出发菌株提高22.06%，且经连续5次传代试验，产量无明显变化。[结论] ARTP对脱落酸产生菌的正变率高、诱变幅度大，所获高产突变株的稳定性好。
关键词 脱落酸；常温室压等离子体；诱变效应
中图分类号 S-03 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）27-0010-02
Abstract [Objective] The aim was to study mutagenic effects of atmospheric and room temperature plasma （ARTP） on abscisic acid （ABA） producing strains to obtain mutants with high ABA production.[Method] ARTP was employed to generatethe mutants under the conditions of 100 W power supply，the plasma temperature of 25 ℃，gas flow of 10 SLM，and irradiation distance of 2 mm.The spore of Botrytis cinerea was treated by different mutation time.The statistical analysis of the mutagenic effects was carried out in terms of lethality，positive mutation rate and amplitude of variation.[Result] The positive mutation rate was above 20% and amplitude of variation was-30.53%-22.06% under the condition of 100 s treatment time with ARTP.The highyield mutant 6-2 had an increase of 22.06% comparing with the original strain，and the yield did not change significantly after five consecutive passage tests.[Conclusion] The ARTP mutation method has a high positive mutation rate and better stability on ABA producing strains.The stability of highyield mutant is good.
Key words Abscisic acid；ARTP；Mutagenic effects
脫落酸（ABA）是一种重要的植物激素，参与植物胚胎发育、种子休眠、果实成熟和逆境胁迫等许多方面，对植物生长发育起着重要调节作用[1]。植物接受胁迫信号，影响基因的表达，引起植物体内ABA 水平上升，从而增加植物的抗逆性[2] 。通过施用外源ABA可提高作物抗寒、抗旱、抗盐能力，在果树移植、种子储存、花卉园艺等领域有广阔的应用前景，但其生产成本较高是限制其农业应用的一个重要因素。微生物发酵法生产是近年来兴起的新的脱落酸生产方法[3]，而提高菌种的发酵产量是降低成本的关键因素之一。通过菌种诱变是提高发酵产量的方法之一，寻求好的诱变方法是关键。
常压室温等离子体（ARTP）诱变方法不仅具有获得突变菌株的效率高、突变菌株的遗传稳定性好等特点，而且操作简便、安全、诱变效果稳定且无污染。与之前的化学诱变（如氯化锂）和物理诱变（如紫外）等方法相比，ARTP诱变方法具有显著优势。通过定量分析与测定不同诱变方式对遗传物质的损伤程度得出，ARTP产生更加强烈的DNA损伤和更高的突变率。因此，ARTP诱变方法在工业微生物育种中得到越来越广泛的应用[4]。ARTP作为一种新型操作简便、低成本的物理方法，在微生物育种及医疗消毒领域具有广泛的应用潜力，主要是利用了ARTP在放电时产生的各种电子流对微生物基因进行损伤从而诱导其进行诱变。其诱变机理是ARTP对菌株出现遗传物质损伤后，微生物启动SOS修复机制，其诱导产生DNA聚合酶 Ⅳ 和 Ⅴ，它们不具有3′核酸外切酶校正功能，于是在DNA键的损伤部位即使出现不配对碱基，复制仍能继续前进，在此情况下允许错配可增加存活的机会。ARTP对遗传物质造成的损伤多样性较高，又加上SOS诱导修复本身为容错性修复，因此，ARTP多样性的损伤将可能在修复过程中包含于DNA链中。在微生物进行复制修复时，其可能带来多样性的错配可能。损伤的多样性和SOS修复都存在较高的错配概率，都可大大增加有利突变的出现概率[5]，同时具有突变后稳定性较高等优点。基于以上诱变特点，笔者对产脱落酸菌进行诱变分析，研究了其诱变效应情况，以期通过ARTP诱变筛选得到脱落酸高产菌株。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种与仪器。常压室温等离子体诱变仪（源清天木生物科技有限公司）。脱落酸产生菌灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea）由中国科学院成都生物研究所提供。 1.1.2 培养基。固体培养基：马铃薯200.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，琼脂15.0～20.0 g/L。种子培养基：葡萄糖300 g/L，牛肉膏1.0 g/L，麦麸100 g/L，蔗糖100 g/L，NH4NO3 15.0 g/L，MgSO4 0.5 g/L，麦芽糖3.0 g/L。摇瓶发酵培养基： 糊精50.0 g/L，麦麸10.0 g/L，葡萄糖40 g/L，硫酸镁0.1 g/L，大豆蛋白粉4.0 g/L。
1.2 方法
1.2.1 斜面菌株的培养。
将冷冻管保藏的原种解冻后均匀涂布于制备好的空白斜面上，23～28 ℃培养8 d左右，培养好后置于冰箱备用。
1.2.2 孢子悬浮液的制备。吸取适量无菌水加入到制备好的菌株斜面，用竹签刮下孢子，倒入到含有玻璃珠的三角瓶中，在旋转摇床上充分振荡成分散悬浮液。悬浮液试验用多层无菌擦镜纸过滤除菌丝，得到孢子悬浮液。
1.2.3 诱变载片的样品制备。在无菌条件下，将“1.2.2”制备的悬浮液用100 μL移液器吸取10 μL滴加到灭菌载片上，并涂布均匀使孢子液覆盖全部载片。
1.2.4 ARTP诱变。ARTP仪诱变操作前通入氦气（He）进行机器预热。该诱变装置采用99.999%高纯氦气（He）作为产生等离子体的出发气体，电源功率为100 W，工作距离为2 mm，等离子体温度为25 ℃，气流量为10 SLM。在气流量、辐射距离确定的情况下，ARTP对样品的作用效果取决于照射时间的大小。分别设定孢子悬浮液诱变的暴露时间为50、60、70、80、90和100 s 6个不同的照射时间。在ARTP诱变仪下分别进行上述不同处理时间的照射，照射结束后，立即用无菌镊子取出样品载片，置于装有适量无菌水的10 mL EP管中，利用旋涡混合器剧烈振荡1 min，全部洗下载片上的孢子并悬浮于无菌水中。将样品进行梯度稀释后，取0.1 mL涂布琼脂培养基平板，23～28 ℃培养8 d左右，每个不同时间和浓度各设5个平行。统计不同诱变时间下的致死率。在不同的诱变剂量下，细胞的致死率计算公式：
Lethality=（T-A） /T
式中，T为样品在未经ARTP处理时的总菌落数；A是样品在ARTP处理后存活的菌落数。
1.2.5 S-ABA初筛-打孔浸提法。
将分离的单菌落均匀涂布于装有20 mL PDA的直径9 cm的平皿上，于黑暗中倒置培养8 d。用直径4.5 mm的打孔器取出PDA平皿上的单菌落琼脂块，用丙酮浸提过夜，蒸干丙酮及水分后，用甲醇-水溶液（6∶4，V/V）定容至10.0 mL，用HPLC测定S-ABA含量[6]。
1.2.6 高产诱变株的稳定性试验。
在打孔浸提前，将打孔的菌落各转接斜面2支，对通过菌落打孔浸提法初筛选出的高产单菌落进行稳定性分析。从各个剂量中选出1株高产菌株进行连续5次传代。各传代斜面接种于种子培养基中，以20%的移种量移至250 mL发酵摇瓶中，23～28 ℃培养8 d后采用HPLC测定摇瓶料液的ABA浓度。
1.2.7 產物检测法——HPLC法。
流动相：甲醇∶水∶乙酸按60∶40∶0.5体积比例混合均匀，用0.45 μm过滤器抽滤。分析条件：检测流速为0.8 mL/min，紫外检测波长为260 nm，常温，进样量为20 μL。
1.2.8 诱变正变率及变异幅度的统计。涂布的琼脂培养基平板经过23～28 ℃培养8 d左右，对各平板的菌落进行打孔浸提测菌落的ABA，每个诱变平板打孔3个菌落，对照平皿打孔2个菌落作为对照，通过对比诱变平皿菌落ABA和对照平皿ABA数据计算其正变率。各个诱变剂量所测数据以对照数据为中心，计算其正负变异幅度的大小。
2 结果与分析
2.1 多层无菌擦镜纸过滤去除孢子悬液中菌丝的效果
采用1、2、3、4层不同层数的擦镜纸过滤后的孢子悬浮液进行血球计数板计数，其孢子纯度和孢子数量统计结果见表1。由表1可知，擦镜纸层数越多，孢子悬液纯度越高，但孢子也有部分被过滤掉，用3层擦镜纸过滤较合适。
2.2 ARTP诱变致死率 由图1可知，在一定剂量内，随着照射时间的延长，致死率增加。
2.3 ARTP诱变正变率和诱变幅度
由表2可知，在100 s的照剂剂量下，正变率为20.00%，变异幅度在-30.53%～22.06%。
2.4 高产突变菌株的稳定性
由表3可知，6株高产突变株经连续5次传代，其产酸能力无明显变化，性能稳定。
3 结论与讨论
ARTP诱变育种的原理是其发出的等离子体流作用于丝状真菌等微生物，它作为一种新型的诱变方式，能够对微生物的遗传物质产生强烈的畸变作用，使得微生物的基因序列和代谢网络发生较大的差异，进而使微生物发生稳定遗传的突变[7]。该研究针对脱落酸产生菌用ARTP对6个不同剂量诱变孢子悬浮液进行了初步的探索，并未对脱落酸产生菌原生质体进行诱变处理，后续研究需用原生质体进行诱变处理，对比诱变效果。
菌种的生产能力是发酵高产的前提[8]，ARTP诱变脱落酸产生菌能有效提高其生产能力，其随着诱变剂量的增加，虽然正变率呈下降趋势，但诱变幅度增大，菌株的稳定性好。通过提高菌种生产水平能大幅降低生产成本，达到提高经济效益的目的。
参考文献
[1]
LI S，ASSMANN S M，ALBERT R.Predicting essential components of signal transduction networks：A dynamic model of guard cell abscisic acid signaling[J].PLoS Biology，2006，4（10）：1-17. [2] FREY A，GODIN B，BONNET M，et al.Maternal synthesis of abscisic acid controls seed development and yield in Nicotiana plumbaginifolia[J].Planta，2004，218（6）：958-964.
[3] 施天穹，彭輝，季荣钰，等.微生物发酵法产脱落酸的研究进展[J].化工进展，2016，35（7）：2140-2144.
[4] LI X Y，LIU R J，LI J，et al.Enhanced arachidonic acid production from Mortierella alpina combining atmospheric and room temperature plasma （ARTP） and diethyl sulfate treatments[J].Bioresource technology，2015，177（1）：134-140.
[5] WANG Q，FENG L R，WEI L，et al.Mutation breeding of lycopeneproducing strain Blakeslea trispora by a novel atmospheric and room temperature plasma （ARTP）[J].Applied biochemistry and biotechnology， 2014，174（1）：452-460.
[6] 谭红，周金燕.脱落酸研究与应用[M].北京：科学出版社，2014.
[7] 黎亮，王泽建，郭美锦，等.头孢菌素C产生菌的诱变育种及培养基优化[J].中国生物工程杂志，2014，34（8）：61-66.
[8] ZHANG X，ZHANG C，ZHOU Q Q，et al.Quantitative evaluation of DNA damage and mutation rate by atmospheric and roomtemperature plasma （ARTP） and conventional mutagenesis[J]. Appllied microbiology and biotechnology，2015，99（13）：5639-5646.
关键词 脱落酸；常温室压等离子体；诱变效应
中图分类号 S-03 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）27-0010-02
Abstract [Objective] The aim was to study mutagenic effects of atmospheric and room temperature plasma （ARTP） on abscisic acid （ABA） producing strains to obtain mutants with high ABA production.[Method] ARTP was employed to generatethe mutants under the conditions of 100 W power supply，the plasma temperature of 25 ℃，gas flow of 10 SLM，and irradiation distance of 2 mm.The spore of Botrytis cinerea was treated by different mutation time.The statistical analysis of the mutagenic effects was carried out in terms of lethality，positive mutation rate and amplitude of variation.[Result] The positive mutation rate was above 20% and amplitude of variation was-30.53%-22.06% under the condition of 100 s treatment time with ARTP.The highyield mutant 6-2 had an increase of 22.06% comparing with the original strain，and the yield did not change significantly after five consecutive passage tests.[Conclusion] The ARTP mutation method has a high positive mutation rate and better stability on ABA producing strains.The stability of highyield mutant is good.
Key words Abscisic acid；ARTP；Mutagenic effects
脫落酸（ABA）是一种重要的植物激素，参与植物胚胎发育、种子休眠、果实成熟和逆境胁迫等许多方面，对植物生长发育起着重要调节作用[1]。植物接受胁迫信号，影响基因的表达，引起植物体内ABA 水平上升，从而增加植物的抗逆性[2] 。通过施用外源ABA可提高作物抗寒、抗旱、抗盐能力，在果树移植、种子储存、花卉园艺等领域有广阔的应用前景，但其生产成本较高是限制其农业应用的一个重要因素。微生物发酵法生产是近年来兴起的新的脱落酸生产方法[3]，而提高菌种的发酵产量是降低成本的关键因素之一。通过菌种诱变是提高发酵产量的方法之一，寻求好的诱变方法是关键。
常压室温等离子体（ARTP）诱变方法不仅具有获得突变菌株的效率高、突变菌株的遗传稳定性好等特点，而且操作简便、安全、诱变效果稳定且无污染。与之前的化学诱变（如氯化锂）和物理诱变（如紫外）等方法相比，ARTP诱变方法具有显著优势。通过定量分析与测定不同诱变方式对遗传物质的损伤程度得出，ARTP产生更加强烈的DNA损伤和更高的突变率。因此，ARTP诱变方法在工业微生物育种中得到越来越广泛的应用[4]。ARTP作为一种新型操作简便、低成本的物理方法，在微生物育种及医疗消毒领域具有广泛的应用潜力，主要是利用了ARTP在放电时产生的各种电子流对微生物基因进行损伤从而诱导其进行诱变。其诱变机理是ARTP对菌株出现遗传物质损伤后，微生物启动SOS修复机制，其诱导产生DNA聚合酶 Ⅳ 和 Ⅴ，它们不具有3′核酸外切酶校正功能，于是在DNA键的损伤部位即使出现不配对碱基，复制仍能继续前进，在此情况下允许错配可增加存活的机会。ARTP对遗传物质造成的损伤多样性较高，又加上SOS诱导修复本身为容错性修复，因此，ARTP多样性的损伤将可能在修复过程中包含于DNA链中。在微生物进行复制修复时，其可能带来多样性的错配可能。损伤的多样性和SOS修复都存在较高的错配概率，都可大大增加有利突变的出现概率[5]，同时具有突变后稳定性较高等优点。基于以上诱变特点，笔者对产脱落酸菌进行诱变分析，研究了其诱变效应情况，以期通过ARTP诱变筛选得到脱落酸高产菌株。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种与仪器。常压室温等离子体诱变仪（源清天木生物科技有限公司）。脱落酸产生菌灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea）由中国科学院成都生物研究所提供。 1.1.2 培养基。固体培养基：马铃薯200.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，琼脂15.0～20.0 g/L。种子培养基：葡萄糖300 g/L，牛肉膏1.0 g/L，麦麸100 g/L，蔗糖100 g/L，NH4NO3 15.0 g/L，MgSO4 0.5 g/L，麦芽糖3.0 g/L。摇瓶发酵培养基： 糊精50.0 g/L，麦麸10.0 g/L，葡萄糖40 g/L，硫酸镁0.1 g/L，大豆蛋白粉4.0 g/L。
1.2 方法
1.2.1 斜面菌株的培养。
将冷冻管保藏的原种解冻后均匀涂布于制备好的空白斜面上，23～28 ℃培养8 d左右，培养好后置于冰箱备用。
1.2.2 孢子悬浮液的制备。吸取适量无菌水加入到制备好的菌株斜面，用竹签刮下孢子，倒入到含有玻璃珠的三角瓶中，在旋转摇床上充分振荡成分散悬浮液。悬浮液试验用多层无菌擦镜纸过滤除菌丝，得到孢子悬浮液。
1.2.3 诱变载片的样品制备。在无菌条件下，将“1.2.2”制备的悬浮液用100 μL移液器吸取10 μL滴加到灭菌载片上，并涂布均匀使孢子液覆盖全部载片。
1.2.4 ARTP诱变。ARTP仪诱变操作前通入氦气（He）进行机器预热。该诱变装置采用99.999%高纯氦气（He）作为产生等离子体的出发气体，电源功率为100 W，工作距离为2 mm，等离子体温度为25 ℃，气流量为10 SLM。在气流量、辐射距离确定的情况下，ARTP对样品的作用效果取决于照射时间的大小。分别设定孢子悬浮液诱变的暴露时间为50、60、70、80、90和100 s 6个不同的照射时间。在ARTP诱变仪下分别进行上述不同处理时间的照射，照射结束后，立即用无菌镊子取出样品载片，置于装有适量无菌水的10 mL EP管中，利用旋涡混合器剧烈振荡1 min，全部洗下载片上的孢子并悬浮于无菌水中。将样品进行梯度稀释后，取0.1 mL涂布琼脂培养基平板，23～28 ℃培养8 d左右，每个不同时间和浓度各设5个平行。统计不同诱变时间下的致死率。在不同的诱变剂量下，细胞的致死率计算公式：
Lethality=（T-A） /T
式中，T为样品在未经ARTP处理时的总菌落数；A是样品在ARTP处理后存活的菌落数。
1.2.5 S-ABA初筛-打孔浸提法。
将分离的单菌落均匀涂布于装有20 mL PDA的直径9 cm的平皿上，于黑暗中倒置培养8 d。用直径4.5 mm的打孔器取出PDA平皿上的单菌落琼脂块，用丙酮浸提过夜，蒸干丙酮及水分后，用甲醇-水溶液（6∶4，V/V）定容至10.0 mL，用HPLC测定S-ABA含量[6]。
1.2.6 高产诱变株的稳定性试验。
在打孔浸提前，将打孔的菌落各转接斜面2支，对通过菌落打孔浸提法初筛选出的高产单菌落进行稳定性分析。从各个剂量中选出1株高产菌株进行连续5次传代。各传代斜面接种于种子培养基中，以20%的移种量移至250 mL发酵摇瓶中，23～28 ℃培养8 d后采用HPLC测定摇瓶料液的ABA浓度。
1.2.7 產物检测法——HPLC法。
流动相：甲醇∶水∶乙酸按60∶40∶0.5体积比例混合均匀，用0.45 μm过滤器抽滤。分析条件：检测流速为0.8 mL/min，紫外检测波长为260 nm，常温，进样量为20 μL。
1.2.8 诱变正变率及变异幅度的统计。涂布的琼脂培养基平板经过23～28 ℃培养8 d左右，对各平板的菌落进行打孔浸提测菌落的ABA，每个诱变平板打孔3个菌落，对照平皿打孔2个菌落作为对照，通过对比诱变平皿菌落ABA和对照平皿ABA数据计算其正变率。各个诱变剂量所测数据以对照数据为中心，计算其正负变异幅度的大小。
2 结果与分析
2.1 多层无菌擦镜纸过滤去除孢子悬液中菌丝的效果
采用1、2、3、4层不同层数的擦镜纸过滤后的孢子悬浮液进行血球计数板计数，其孢子纯度和孢子数量统计结果见表1。由表1可知，擦镜纸层数越多，孢子悬液纯度越高，但孢子也有部分被过滤掉，用3层擦镜纸过滤较合适。
2.2 ARTP诱变致死率 由图1可知，在一定剂量内，随着照射时间的延长，致死率增加。
2.3 ARTP诱变正变率和诱变幅度
由表2可知，在100 s的照剂剂量下，正变率为20.00%，变异幅度在-30.53%～22.06%。
2.4 高产突变菌株的稳定性
由表3可知，6株高产突变株经连续5次传代，其产酸能力无明显变化，性能稳定。
3 结论与讨论
ARTP诱变育种的原理是其发出的等离子体流作用于丝状真菌等微生物，它作为一种新型的诱变方式，能够对微生物的遗传物质产生强烈的畸变作用，使得微生物的基因序列和代谢网络发生较大的差异，进而使微生物发生稳定遗传的突变[7]。该研究针对脱落酸产生菌用ARTP对6个不同剂量诱变孢子悬浮液进行了初步的探索，并未对脱落酸产生菌原生质体进行诱变处理，后续研究需用原生质体进行诱变处理，对比诱变效果。
菌种的生产能力是发酵高产的前提[8]，ARTP诱变脱落酸产生菌能有效提高其生产能力，其随着诱变剂量的增加，虽然正变率呈下降趋势，但诱变幅度增大，菌株的稳定性好。通过提高菌种生产水平能大幅降低生产成本，达到提高经济效益的目的。
参考文献
[1]
LI S，ASSMANN S M，ALBERT R.Predicting essential components of signal transduction networks：A dynamic model of guard cell abscisic acid signaling[J].PLoS Biology，2006，4（10）：1-17. [2] FREY A，GODIN B，BONNET M，et al.Maternal synthesis of abscisic acid controls seed development and yield in Nicotiana plumbaginifolia[J].Planta，2004，218（6）：958-964.
[3] 施天穹，彭輝，季荣钰，等.微生物发酵法产脱落酸的研究进展[J].化工进展，2016，35（7）：2140-2144.
[4] LI X Y，LIU R J，LI J，et al.Enhanced arachidonic acid production from Mortierella alpina combining atmospheric and room temperature plasma （ARTP） and diethyl sulfate treatments[J].Bioresource technology，2015，177（1）：134-140.
[5] WANG Q，FENG L R，WEI L，et al.Mutation breeding of lycopeneproducing strain Blakeslea trispora by a novel atmospheric and room temperature plasma （ARTP）[J].Applied biochemistry and biotechnology， 2014，174（1）：452-460.
[6] 谭红，周金燕.脱落酸研究与应用[M].北京：科学出版社，2014.
[7] 黎亮，王泽建，郭美锦，等.头孢菌素C产生菌的诱变育种及培养基优化[J].中国生物工程杂志，2014，34（8）：61-66.
[8] ZHANG X，ZHANG C，ZHOU Q Q，et al.Quantitative evaluation of DNA damage and mutation rate by atmospheric and roomtemperature plasma （ARTP） and conventional mutagenesis[J]. Appllied microbiology and biotechnology，2015，99（13）：5639-5646.