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摘要 为研究硬枝黄蝉Allemanda neriifolia Hook.乙醇提取物的抑菌活性，本研究采用减压柱层析、薄层色谱等对其乙醇提取物的抑菌成分进行了初步分离，以胡椒瘟病菌Phytophthora capsici为供试病原菌，测定了不同馏分对胡椒瘟病菌的抑菌活性。结果表明，石油醚萃取组分（AN-LS1）、氯仿萃取组分（AN-LS2）、乙酸乙酯萃取组分（AN-LS3）对胡椒瘟病菌均具有一定抑菌活性，抑制率分别为69.59%、66.73%和15.10%。对3种萃取组分采用活性跟踪分离，发现馏分AN-LS1-05、AN-LS1-06、AN-LS2-03、AN-LS2-04、AN-LS2-05、AN-LS3-02、AN-LS3-03對胡椒瘟病菌抑制率达到了100%，馏分AN-LS2-06、AN-LS2-07和AN-LS3-04抑制率达到了80%。对各馏分进一步分离最终得到AN-LS1-05-04、AN-LS1-07-07、AN-LS2-04-04、AN-LS2-06-05-06、AN-LS3-04-06等16个化合物，其化学结构有待进一步鉴定。
关键词 硬枝黄蝉; 胡椒瘟病菌; 抑菌活性; 馏分
中图分类号： S 435.73
文献标识码： A
DOI： 10.16688/j.zwbh.2019514
Abstract In order to investigate the inhibitory activity of ethanol extract from Allemanda neriifolia Hook.， the inhibitory components was separated from the ethanol extract by pressure reducing column chromatography and TLC method with Phytophthora capsici as tested pathogen. The result showed that petroleum ether （AN-LS1）， chloroform （AN-LS2） and acetic ether extraction （AN-LS3） had certain inhibitory activity， with the inhibition ratios of 69.59%， 66.73% and 15.10%， respectively. By active tracking separation of the three extraction components， AN-LS1-05， AN-LS1-06， AN-LS2-03， AN-LS2-04， AN-LS2-05， AN-LS3-02 and AN-LS3-03 were found to exhibit high inhibition ratio of 100%， Besides， the inhibition ratios of other three fractions （AN-LS2-06，AN-LS2-07 and AN-LS3-04） reached 80%. The 16 components were separated， such as AN-LS1-05-04， AN-LS1-07-07， AN-LS2-04-04， AN-LS2-06-05-06， AN-LS3-04-06 and so on， and their chemical structures remain to be further identified.
Key words Allemanda neriifolia; Phytophthora capsici; inhibitory activity; fraction
胡椒Piper nigrum Linn.在世界上各种香料中占有主导地位，在欧洲和北美等国家都有食用。胡椒瘟病是世界各胡椒生产地区最重要的病害，由疫霉Phytophthora capsici侵染引起的一种传染力很强的土传病害，常在雨季发生。海南自引种种植以来，该病就一直是危害胡椒生产的首要病害，最严重的胡椒园损失可达90%以上[1]。国内刘进平等和邢谷扬综述了胡椒瘟病的化学防治技术[2-3]。国外Kasim研究了甲霜灵、疫霜灵等对胡椒瘟病的室内和大田防治效果[4]。Anandaraj等关于印楝、飞机草等植物提取液对胡椒瘟病病原菌抑制效果的研究发现，0.2%的飞机草提取液具有较好的抑制作用[5]。Ezziyyani等利用哈茨木霉Trichoderma harzianum和娄彻氏链霉菌Streptomyces rochei对胡椒瘟病进行了生物防治研究[6]。
硬枝黄蝉Allemanda neriifolia Hook.是夹竹桃科Apocynaceae黄蝉属Allemanda植物，常绿灌木，原产巴西，中国亚热带地区的广东、福建、广西、台湾等地有引种，现广泛栽培于热带地区，为观赏植物[7]。林同等[8]研究发现硬枝黄蝉花的乙醇提取物对白蚁具有一定防治效果，冯岗等[9]、张静等[10]研究发现软枝黄蝉提取物对螺旋粉虱成虫、椰心叶甲具有一定毒杀活性。苟亚峰等[11]对23种热带植物抑菌活性筛选中发现蔓马缨丹等对胡椒瘟病菌具有较好抑菌活性。因此，本试验以胡椒瘟病菌为供试病原菌，采用活性跟踪法[12]分离硬枝黄蝉乙醇提取物中对胡椒瘟病菌具有抑菌活性的成分，为进一步研制防治胡椒瘟病的植物源杀菌剂提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试植物提取物
硬枝黄蝉Allemanda neriifolia Hook.枝叶采自中国热带农业科学院香料饮料研究所内。将新鲜的硬枝黄蝉枝叶充分阴干，粉碎后过40目筛。采用冷浸法加入干粉5倍量的乙醇分别浸提24、48、72 h，过滤，合并3次滤液并减压浓缩，获得硬枝黄蝉乙醇提取物浸膏，备用。 1.1.2 供试病原菌
胡椒瘟病菌Phytophthora capsici由中国热带农业科学院香料饮料研究所病虫害防控研究室分离提供，接种于PDA培养基上保存备用。
1.2 方法
1.2.1 萃取组分的制备方法
参照苟亚峰等[13]方法，称取硬枝黄蝉枝叶提取物浸膏20 g溶于10倍量的去离子水中，制成悬浮液，再依次用10倍量的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次分别萃取3次，合并各溶剂萃取液并减压浓缩，冷冻干燥除去溶剂分别得到石油醚萃取组分（AN-LS1）、氯仿萃取组分（AN-LS2）、乙酸乙酯萃取组分（AN-LS3）、正丁醇萃取组分（AN-LS4）、水相（AN-LS5），备用。
1.2.2 抗菌活性测定方法
采用菌丝生长速率法[14]测定抑菌活性。用移液枪取1 mL配制好的药液，加入到20 mL灭菌刻度试管中，再加入PDA培养基定容至10 mL，混匀后倒入灭菌培养皿中，冷却。用灭菌打孔器（内径4 mm）在生长有菌丝的培养皿上打取菌饼，然后用接种针将菌饼接到带药PDA平板中心。每种药液做3个重复，以溶剂作对照，放25℃恒温条件下培养。5 d后用十字交叉法测量菌落直径，记录数据并按以下公式计算抑制率：
1.2.3 抑菌活性成分分离方法
称取不同溶剂萃取组分，用有机溶剂溶解，加入0.5倍量100～200目的硅胶，搅拌均匀，放置于烧杯中晾干成粉末状样品，采用减压柱层析干法装柱。根据薄层色谱（TLC）分离情况，选择洗脱剂分别进行洗脱。每次洗脱加入洗脱剂200 mL，抽干后进行下一次洗脱，各洗脱馏分采用TLC展板对比，合并相近馏分，测定抑菌活性，对抑菌活性较高的馏分重复上述步骤继续进行分离。
1.3 数据分析
用SPSS软件中Duncan氏新复极差法对数据进行单因素方差分析及各组处理数据间的显著性分析和比较。
2 结果与分析
2.1 AN-LS各萃取组分抑菌活性测定
从硬枝黄蝉乙醇提取物AN-LS1、AN-LS2、AN-LS3、AN-LS4、AN-LS5 5个萃取组分抑菌活性测定结果（表1）可以看出，不同极性有机溶剂萃取硬枝黄蝉乙醇提取物后各萃取组分对胡椒瘟病菌的抑菌活性不同，其中抑菌活性主要集中在AN-LS1和AN-LS2中，AN-LS3抑菌活性次之。
2.2 AN-LS各萃取组分抑菌活性成分分离
对抑菌活性较强的AN-LS1、AN-LS2、AN-LS3萃取组分分别进行分离。AN-LS1分离后共获得AN-LS1-01～AN-LS1-12 12个馏分。AN-LS2分离后共获得AN-LS2-01～AN-LS2-10 10个馏分。AN-LS3分离后共获得AN-LS3-01～AN-LS3-10 10个馏分。
2.3 AN-LS1、AN-LS2、AN-LS3各馏分抑菌活性测定
对AN-LS1、AN-LS2、AN-LS3各馏分抑菌活性进行测定，结果见表2～4。
3 讨论
从硬枝黄蝉乙醇提取物石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取组分对胡椒瘟病菌抑菌活性测定结果可以看出，石油醚、氯仿萃取组分对胡椒瘟病菌的抑菌活性达到了50%以上，乙酸乙酯萃取组分抑菌率仅为15.10%，但对这3种萃取组分进一步分离时发现，馏分AN-LS1-05、AN-LS1-06、AN-LS2-03、AN-LS2-04、AN-LS2-05、AN-LS3-02、AN-LS3-03对胡椒瘟病菌抑菌活性均达到了100%，由此可以推断硬枝黄蝉乙醇提取物中对胡椒瘟病菌抑菌活性成分有富集的現象，具体分离的16种化合物对胡椒瘟病菌的抑菌活性有待进一步研究。植物源农药的有效成分是植物体中的次生代谢产物，具有环境友好、对非靶标生物安全、不易产生抗药性、作用方式特异、促进作物生长并提高抗病性等特点，从植物中分离纯化具有农药活性的新物质，以此先导化合物为结构模板，进行结构的多级优化，创制高效低毒新农药是植物农药的研究重点[15]。目前，进入工业化生产的像苦参碱、印楝素、鱼藤酮等植物源生物农药在我国农业生产实践中的广泛应用使植物源生物农药的推广有了长足的进步[16]。下一步将对硬枝黄蝉乙醇提取物中分离的16种化合物进行结构鉴定，有望为开发新的防治胡椒瘟病的植物源杀菌剂奠定基础。
参考文献
[1] 桑利伟， 刘爱勤，谭乐和，等.海南省胡椒瘟病病原鉴定及发生规律[J].植物保护，2011，37（6）：168-171.
[2] 刘进平，郑成木，郑服丛.胡椒瘟病与辣椒疫霉[J].热带农业科学，2001（5）：27-31.
[3] 邢谷杨.胡椒无公害生产及其主要病虫害防治[J].广西热带农业，2004（6）：34-35.
[4] KASIM R.The control of foot rot disease of pepper caused by Phytophthora palmivora using fungicides [J].Edisi Khusus Penelitian Tanaman Rempah Dan Obat，1986，11（2）：63-66.
[5] ANANDARAJ M，LEELA N K. Toxic effect of some plant extracts on Phytophthora capsici， the foot rot pathogen of black pepper [J].Indian Phytopathology，1996，49（2）：181-184.
[6] EZZIYYANI M，REQUENA M E，EGEA-GILABERT C， et al. Biological control of Phytophthora root rot of pepper using Trichoderma harzianum and Streptomyces rochei in combination [J].Journal of Phytopathology，2007，155（6）：342-349.
[7] 中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志（第六十三卷）[M].北京：科学出版社，1977：73-78.
[8] 林同，陆宁将，樊绪富，等.黄蝉和驳骨丹对橄榄星室木虱的毒杀活性[J].中国森林病虫，2006，25（5）：41-42.
[9] 冯岗，闫超，张静.软枝黄蝉提取物对螺旋粉虱的杀虫活性[J].热带农业科学，2013，33（7）：54-57.
[10]张静，冯岗.软枝黄蝉提取物对椰心叶甲的杀虫活性[J].热带作物学报，2010，31（7）：1152-1156.
[11]苟亚峰，刘爱勤，孙世伟，等.23种植物提取物对胡椒瘟病病原菌的抑制作用[J].植物保护，2010，36（6）：128-131.
[12]杨震发，袁呈山，杨顺义，等.黄花棘豆抑制植物病原菌的活性成分研究[J].植物保护， 2014， 40（6）：59-64.
[13]苟亚峰，孙世伟，高圣风，等.圆滑番荔枝叶乙醇提取物不同萃取组分对胡椒瘟病菌的抑菌活性测定[J].热带农业科学，2014，34（4）：60-62.
[14]吴文君.植物化学保护实验技术导论[M].西安：陕西科学技术出版社，1988.
[15]何军，马志卿，张兴.植物源农药概述[J].西北农林科技大学学报（自然科学版），2006，34（9）：79-85.
[16]邱德文.生物农药—未来农药发展的新趋势[J].中国农村科技，2017（11）：36-39.
（责任编辑：杨明丽）
关键词 硬枝黄蝉; 胡椒瘟病菌; 抑菌活性; 馏分
中图分类号： S 435.73
文献标识码： A
DOI： 10.16688/j.zwbh.2019514
Abstract In order to investigate the inhibitory activity of ethanol extract from Allemanda neriifolia Hook.， the inhibitory components was separated from the ethanol extract by pressure reducing column chromatography and TLC method with Phytophthora capsici as tested pathogen. The result showed that petroleum ether （AN-LS1）， chloroform （AN-LS2） and acetic ether extraction （AN-LS3） had certain inhibitory activity， with the inhibition ratios of 69.59%， 66.73% and 15.10%， respectively. By active tracking separation of the three extraction components， AN-LS1-05， AN-LS1-06， AN-LS2-03， AN-LS2-04， AN-LS2-05， AN-LS3-02 and AN-LS3-03 were found to exhibit high inhibition ratio of 100%， Besides， the inhibition ratios of other three fractions （AN-LS2-06，AN-LS2-07 and AN-LS3-04） reached 80%. The 16 components were separated， such as AN-LS1-05-04， AN-LS1-07-07， AN-LS2-04-04， AN-LS2-06-05-06， AN-LS3-04-06 and so on， and their chemical structures remain to be further identified.
Key words Allemanda neriifolia; Phytophthora capsici; inhibitory activity; fraction
胡椒Piper nigrum Linn.在世界上各种香料中占有主导地位，在欧洲和北美等国家都有食用。胡椒瘟病是世界各胡椒生产地区最重要的病害，由疫霉Phytophthora capsici侵染引起的一种传染力很强的土传病害，常在雨季发生。海南自引种种植以来，该病就一直是危害胡椒生产的首要病害，最严重的胡椒园损失可达90%以上[1]。国内刘进平等和邢谷扬综述了胡椒瘟病的化学防治技术[2-3]。国外Kasim研究了甲霜灵、疫霜灵等对胡椒瘟病的室内和大田防治效果[4]。Anandaraj等关于印楝、飞机草等植物提取液对胡椒瘟病病原菌抑制效果的研究发现，0.2%的飞机草提取液具有较好的抑制作用[5]。Ezziyyani等利用哈茨木霉Trichoderma harzianum和娄彻氏链霉菌Streptomyces rochei对胡椒瘟病进行了生物防治研究[6]。
硬枝黄蝉Allemanda neriifolia Hook.是夹竹桃科Apocynaceae黄蝉属Allemanda植物，常绿灌木，原产巴西，中国亚热带地区的广东、福建、广西、台湾等地有引种，现广泛栽培于热带地区，为观赏植物[7]。林同等[8]研究发现硬枝黄蝉花的乙醇提取物对白蚁具有一定防治效果，冯岗等[9]、张静等[10]研究发现软枝黄蝉提取物对螺旋粉虱成虫、椰心叶甲具有一定毒杀活性。苟亚峰等[11]对23种热带植物抑菌活性筛选中发现蔓马缨丹等对胡椒瘟病菌具有较好抑菌活性。因此，本试验以胡椒瘟病菌为供试病原菌，采用活性跟踪法[12]分离硬枝黄蝉乙醇提取物中对胡椒瘟病菌具有抑菌活性的成分，为进一步研制防治胡椒瘟病的植物源杀菌剂提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试植物提取物
硬枝黄蝉Allemanda neriifolia Hook.枝叶采自中国热带农业科学院香料饮料研究所内。将新鲜的硬枝黄蝉枝叶充分阴干，粉碎后过40目筛。采用冷浸法加入干粉5倍量的乙醇分别浸提24、48、72 h，过滤，合并3次滤液并减压浓缩，获得硬枝黄蝉乙醇提取物浸膏，备用。 1.1.2 供试病原菌
胡椒瘟病菌Phytophthora capsici由中国热带农业科学院香料饮料研究所病虫害防控研究室分离提供，接种于PDA培养基上保存备用。
1.2 方法
1.2.1 萃取组分的制备方法
参照苟亚峰等[13]方法，称取硬枝黄蝉枝叶提取物浸膏20 g溶于10倍量的去离子水中，制成悬浮液，再依次用10倍量的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次分别萃取3次，合并各溶剂萃取液并减压浓缩，冷冻干燥除去溶剂分别得到石油醚萃取组分（AN-LS1）、氯仿萃取组分（AN-LS2）、乙酸乙酯萃取组分（AN-LS3）、正丁醇萃取组分（AN-LS4）、水相（AN-LS5），备用。
1.2.2 抗菌活性测定方法
采用菌丝生长速率法[14]测定抑菌活性。用移液枪取1 mL配制好的药液，加入到20 mL灭菌刻度试管中，再加入PDA培养基定容至10 mL，混匀后倒入灭菌培养皿中，冷却。用灭菌打孔器（内径4 mm）在生长有菌丝的培养皿上打取菌饼，然后用接种针将菌饼接到带药PDA平板中心。每种药液做3个重复，以溶剂作对照，放25℃恒温条件下培养。5 d后用十字交叉法测量菌落直径，记录数据并按以下公式计算抑制率：
1.2.3 抑菌活性成分分离方法
称取不同溶剂萃取组分，用有机溶剂溶解，加入0.5倍量100～200目的硅胶，搅拌均匀，放置于烧杯中晾干成粉末状样品，采用减压柱层析干法装柱。根据薄层色谱（TLC）分离情况，选择洗脱剂分别进行洗脱。每次洗脱加入洗脱剂200 mL，抽干后进行下一次洗脱，各洗脱馏分采用TLC展板对比，合并相近馏分，测定抑菌活性，对抑菌活性较高的馏分重复上述步骤继续进行分离。
1.3 数据分析
用SPSS软件中Duncan氏新复极差法对数据进行单因素方差分析及各组处理数据间的显著性分析和比较。
2 结果与分析
2.1 AN-LS各萃取组分抑菌活性测定
从硬枝黄蝉乙醇提取物AN-LS1、AN-LS2、AN-LS3、AN-LS4、AN-LS5 5个萃取组分抑菌活性测定结果（表1）可以看出，不同极性有机溶剂萃取硬枝黄蝉乙醇提取物后各萃取组分对胡椒瘟病菌的抑菌活性不同，其中抑菌活性主要集中在AN-LS1和AN-LS2中，AN-LS3抑菌活性次之。
2.2 AN-LS各萃取组分抑菌活性成分分离
对抑菌活性较强的AN-LS1、AN-LS2、AN-LS3萃取组分分别进行分离。AN-LS1分离后共获得AN-LS1-01～AN-LS1-12 12个馏分。AN-LS2分离后共获得AN-LS2-01～AN-LS2-10 10个馏分。AN-LS3分离后共获得AN-LS3-01～AN-LS3-10 10个馏分。
2.3 AN-LS1、AN-LS2、AN-LS3各馏分抑菌活性测定
对AN-LS1、AN-LS2、AN-LS3各馏分抑菌活性进行测定，结果见表2～4。
3 讨论
从硬枝黄蝉乙醇提取物石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取组分对胡椒瘟病菌抑菌活性测定结果可以看出，石油醚、氯仿萃取组分对胡椒瘟病菌的抑菌活性达到了50%以上，乙酸乙酯萃取组分抑菌率仅为15.10%，但对这3种萃取组分进一步分离时发现，馏分AN-LS1-05、AN-LS1-06、AN-LS2-03、AN-LS2-04、AN-LS2-05、AN-LS3-02、AN-LS3-03对胡椒瘟病菌抑菌活性均达到了100%，由此可以推断硬枝黄蝉乙醇提取物中对胡椒瘟病菌抑菌活性成分有富集的現象，具体分离的16种化合物对胡椒瘟病菌的抑菌活性有待进一步研究。植物源农药的有效成分是植物体中的次生代谢产物，具有环境友好、对非靶标生物安全、不易产生抗药性、作用方式特异、促进作物生长并提高抗病性等特点，从植物中分离纯化具有农药活性的新物质，以此先导化合物为结构模板，进行结构的多级优化，创制高效低毒新农药是植物农药的研究重点[15]。目前，进入工业化生产的像苦参碱、印楝素、鱼藤酮等植物源生物农药在我国农业生产实践中的广泛应用使植物源生物农药的推广有了长足的进步[16]。下一步将对硬枝黄蝉乙醇提取物中分离的16种化合物进行结构鉴定，有望为开发新的防治胡椒瘟病的植物源杀菌剂奠定基础。
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[9] 冯岗，闫超，张静.软枝黄蝉提取物对螺旋粉虱的杀虫活性[J].热带农业科学，2013，33（7）：54-57.
[10]张静，冯岗.软枝黄蝉提取物对椰心叶甲的杀虫活性[J].热带作物学报，2010，31（7）：1152-1156.
[11]苟亚峰，刘爱勤，孙世伟，等.23种植物提取物对胡椒瘟病病原菌的抑制作用[J].植物保护，2010，36（6）：128-131.
[12]杨震发，袁呈山，杨顺义，等.黄花棘豆抑制植物病原菌的活性成分研究[J].植物保护， 2014， 40（6）：59-64.
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（责任编辑：杨明丽）