观察大肠杆菌脂多糖(LPS)是否可在体外诱导小鼠血小板凋亡的发生。
方法制备洗涤血小板悬液,调整血小板终浓度至3×108/mL。根据刺激剂不同分为对照组〔无钙台式缓冲液(TB)〕、凝血酶处理组(终浓度1 U/mL,无钙TB制备)和不同浓度LPS处理组(终浓度1、10、100 μg/mL,无钙TB制备)。各组加入相应刺激剂后室温孵育30 min。应用化学发光法检测三磷酸腺苷(ATP)含量及天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)活性;用流式细胞仪检测血小板膜联蛋白Ⅴ(AnnexinⅤ)阳性率以反映磷酯酰丝氨酸(PS)暴露水平;用流式细胞仪测定血小板平均通道荧光强度(MCF)以反映线粒体内膜电位(ΔΨm)去极化。
结果与对照组比较,凝血酶处理组血小板ATP水平明显降低〔相对荧光强度(RLU):(5.46±0.14)×105比(6.25±0.26)×105,P<0.05〕,AnnexinⅤ阳性率〔(50.43±2.45)%比(1.58±0.25)%,P<0.05〕和caspase-3活性〔RLU:(26.92±1.60)×103比(1.30±0.10)×103,P<0.05〕均明显升高,血小板MCF明显降低〔(8.32±0.58)×104比(13.05±1.10)×104,P<0.05〕,说明ΔΨm去极化增加。给予不同浓度LPS处理后,血小板ATP水平、AnnexinⅤ阳性率和caspase-3活性均明显升高,血小板MCF明显降低,说明ΔΨm去极化增加,且呈浓度依赖性。与对照组比较,1 μg/mL LPS即可使AnnexinⅤ阳性率增加〔(10.45±1.08)%比(1.58±0.25)%,P<0.05〕,caspase-3活性升高〔RLU:(14.06±0.61)×103比(1.30±0.10)×103,P<0.05〕,MCF明显降低〔(9.48±0.50)×104比(13.05±1.10)×104,P<0.05〕。经100 μg/mL LPS处理后血小板ATP水平、AnnexinⅤ阳性率和caspase-3活性最高,且均明显高于对照组〔ATP(RLU):(7.00±0.03)×105比(6.25±0.26)×105,AnnexinⅤ阳性率:(55.35±2.42)%比(1.58±0.25)%,caspase-3(RLU):(32.00±3.75)×103比(1.30±0.10)×103,均P<0.05〕;血小板MCF最低,且明显低于对照组〔(4.69±0.55)×104比(13.05±1.10)×104,P<0.05〕。
结论大肠杆菌LPS可体外诱导小鼠血小板ATP升高、PS暴露、ΔΨm去极化及caspase-3活性增加,说明LPS可诱导血小板凋亡,且呈浓度依赖性。