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摘 要：以武夷山脉金线莲的嫩茎段作为外植体，研究其组培快繁技术体系，结果表明：10%次氯酸钙溶液消毒15min对外植体消毒处理效果最佳，存活率达70.0%；嫩茎段在MS+ KT 0.5mg·L-1+IBA0.2mg·L-1培养基下进行增殖培养效果最佳，增殖系数达3.40；培养基中添加100g·L-1马铃薯泥有利于促进芽苗的健壮生长与生根培养。生根苗经过精心培育，成活率达95%以上。
关键词：金线莲；嫩茎段；组培技术
中图分类号 S567 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2018）12-0074-3
金线莲别名金线兰、金丝草，为兰科开唇植物花叶兰属多年生珍稀中草药，使用范围广泛，素有“药王”、“金不换”、“乌人参”等美称。由于金线莲对生长条件要求苛刻，自然繁殖率低，生长缓慢，加上人为过度采挖，致使野生资源濒临绝种。福建省武夷山属亚热带海洋性湿润季风气候，夏无酷暑，冬无严寒，雨量充沛，光热充足，相对湿度较大。得天独厚的地理、气候、水文条件及森林效应，形成了特殊的生态条件，为金线莲生长创造了理想的生态环境，境内金线莲种质资源丰富，药用价值高。近年来，南平市规划创建武夷新区生物产业核心区，同时也在积极建立天然药物药材良种繁育示范基地，以地道药材为基础，建设地道植物药材培育示范基地，逐步建成集原料引种试验、良种繁育、示范、观光于一体的示范带动区域。优质的种质资源是发展生物医药产业的先决条件，为此笔者以武夷山境内经过良种选育出来的野生金线莲种苗作为试验对象开展组培技术的研究，为武夷山脉金线莲道地药材的工厂化生产提供技术支撑。
1 材料与方法
1.1 试验材料 试验材料取自福建省武夷山境内，以经过选优的野生金线莲种苗作为外植体。
1.2 培养基配制和培养条件 以MS作为基本培养基，根据需要添加不同浓度的KT、NAA、IBA等植物激素，并附以琼脂0.6%、蔗糖3%，调整pH值为5.6～5.8，煮沸，待琼脂融化后分装到组培瓶中，在121℃下高压灭菌18～20min，取出冷却凝固后待用。将培养苗置于光照培养架下培养，培养室温度设置在23～27℃，光照强度1500～2000lx，光照时数12h·d-1。
1.3 试验方法
1.3.1 材料的表面灭菌 将取回的野生金线莲种苗剪去叶片后用自来水冲洗干净。接着拿到接种室超净工作台上用75%酒精浸泡外植体20s，无菌水冲洗1次后再进行消毒处理对比试验。把消毒好的外植体剪切成带芽的茎段，接种到诱导培养基中进行培养，30d后统计比较消毒效果，筛选出最佳的外植体消毒方法。消毒试验共设计3个处理（10%次氯酸钙溶液消毒5min+0.1%HgCl2消毒5min、10%次氯酸钙溶液消毒15min、0.1%HgCl2消毒10min）。
1.3.2 芽诱导与增殖培养 本试验选择在MS基本培养基的基础上，外加不同浓度水平的KT和IBA激素，按正交设计组成9个处理，每个处理接种50个茎段，重复3次，40d后统计芽分化数及分化情况。
1.3.3 壮苗与生根培养 将诱导出的芽苗接种到添加不同浓度马铃薯泥的培养基中，研究不同浓度马铃薯泥对金线莲壮苗与生根培养的影响。各试验不同处理、水平代号见表1～表3所示。
2 结果与分析
2.1 不同消毒方法对外植体诱导存活的影响 外植体在接种之前，必须经过严格地消毒灭菌，特别是野外采集回来的外植体，因在自然环境下生长带菌量大，增加消毒的难度。外植体消毒的基本原则是既要彻底地杀灭各种有害菌，又不致于过度损伤组织材料，而影响生长。由表4可知，3种不同消毒处理中，以10%次氯酸钙溶液消毒15min效果好，外植体存活率高，达70%，10%次氯酸钙溶液消毒5min+0.1%HgCl2消毒5min效果次之，达53.3%，单纯用0.1%HgCl2消毒10min效果最差，外植体存活率仅为30%。这可能是因为野生金线莲茎段组织幼嫩，细胞壁薄，而HgCl2溶液较次氯酸钙具有较强的细胞渗透能力，过长消毒时间对组织细胞具有明显的毒害作用，影响外植体存活。因此，武夷山脉金线莲外植体消毒处理应以10%次氯酸钙溶液消毒为主，时间以15min为宜。
2.2 芽诱导与增殖培养 金线莲增殖快繁技术可以通过原球茎增殖和芽苗增殖2种方式进行，采用芽苗增殖方式可以保持原种的优良特性，为良种快繁最主要采用的方式。通过芽苗增殖方式除了选择正确的培养基和适宜的培养环境外，最主要的影响还在于生长调节物质种类和配比浓度。我国植物生理学家发现适宜的细胞分裂素与生长素的浓度比，可以有效地控制植物组织培养过程中芽和根的发生。
由表5可知，培养基中添加KT与IBA激素组合可以有效促进金线莲芽苗增殖。不同浓度激素组合对金线莲芽苗的诱导与增殖影响较大，芽苗的分化系數变动范围为1.72～3.40。本试验中，以中浓度的KT与中高浓度的IBA配合促进芽的增殖效果最明显，芽苗分化系数可达3.0以上。高浓度的KT对金线莲芽的诱导有明显的抑制作用，生长素IBA对芽的伸长生长有明显的促进作用。在试验使用的KT与IBA激素组合中，以KT0.5mg·L-1+IBA0.2mg·L-1组合效果最佳，分化系数达3.40，这对于武夷山脉金线莲组培快繁生产具有重要的现实意义。
2.3 壮苗与生根培养 兰科类植物在组织培养过程中需要添加一定量的马铃薯泥、香蕉泥或椰子汁，可有利于促进培育健壮的植株。在本试验中，通过培养基中添加一定浓度的马铃薯泥（先煮熟再用搅拌机搅成糊状），研究不同浓度的马铃薯泥对芽苗增壮和生根培养的影响。从表6分析得知，培养基中添加一定浓度的马铃薯泥对金线莲植株的生长与生根培养具有明显的促进作用。当每升培养基中添加100g·L-1的马铃薯泥时，金线莲芽苗茎杆粗壮，叶色深绿，芽苗健壮，根数可达3～5条，基本符合驯化移栽的要求，过多或过少均不利于壮苗与生根培养。 2.4 炼苗与移栽 当金线莲瓶苗根系长至1.5～2.5cm左右时，应将生根瓶苗搬到驯化室进行自然环境中炼苗培养。经过约30～50d左右的炼苗培养后，当芽苗茎杆颜色转为褐色，叶片肥厚时，打开瓶盖，再炼苗1～2d，然后小心取出，洗净根部附着的培养基，移植于经过消毒处理的混合基质中。种植前7d，用0.1%高锰酸钾溶液对基质进行消毒。金线莲性喜阴凉、潮湿、通风的环境，基质要求疏松通气。移栽基质应以腐殖土为主，外加一定量的珍珠岩，移栽后应严格控制浇水量，只要保持基质湿润即可。晴天应加盖2层遮阳网，以减少阳光直射，避免灼伤。7d后，可喷多菌灵800倍或托布津1000～1200倍溶液杀菌。经过30d精心培育，小苗平均成活率达95%以上。
3 结论与讨论
（1）外植体灭菌处理应选择合适的消毒剂和消毒方法，既要保证外植体能彻底灭菌，又不至于过度地伤害外植体细胞。武夷山脉金线莲的嫩茎在10%次氯酸钙溶液消毒15min处理下，外植体存活率最高，达70.0%。
（2）武夷山脉金线莲嫩茎诱导与增殖培养基以KT 0.5mg·L-1+IBA0.2mg·L-1组合效果最佳，分化系数达3.40，这对于武夷山脉金线莲组培快繁生产具有重要的现实意义。
（3）在壮苗与生根培养过程中，培养基中添加100g·L-1马铃薯泥有利于促进芽苗的健壮生长，培育壮苗。
（4）金线莲性喜阴凉潮湿通风环境，在移栽管理过程中，应严格控制浇水量，保持基质湿润即可，同时注意做好通风降温遮光处理，经过40d的精心培育，平均成活率可达95%以上。
参考文献
[1]曹春英.植物组织培养[M].北京：中国农业出版社，2006：47-65.
[2]潭文澄.观察植物组织培养技术[M].北京：中国林业出版社，1991：84-141.
[3]崔德才，徐培文.植物组织培养与工厂化育苗[M].北京：化学工业出版社，2003：126-145.
[4]陈剑勇.杉木茎尖诱导愈伤组织及植株再生研究[J].西南林学院学报，2009，24（5）：37-41.
[5]陈剑勇，李宝银，周俊新，等.乌茎段诱导组培快繁技术研究[J].福建林业科技，2009（2）：259-262.
[6]崔德才，徐培文.植物组织培养与工厂化育苗[M].北京：化学工业出版社，2003：126-145.
[7]钟岑生.金线莲的药用价值与开发[J].广西农业科学，1997（2）：102.
[8]黄慧莲等.金线莲种子诱导成苗的研究[J].中药材，2002，（1）.
[9]何云芳等.金線莲组培快繁技术[J].浙江林学院学报，1999，16（2）：170-174.
[10]郑作俐.金线莲增殖培养简报[J].福建农业科技，1998，4：20.
[11]陈裕等.金线莲生长发育与光照强度关系[J].福建热作科技，1996，21（4）：22-23.
[12]]郑维鹏.金线莲组培与移栽技术的研究[J].福建林学院学报，1995，15（4）：337-341.
（责编：张宏民）
关键词：金线莲；嫩茎段；组培技术
中图分类号 S567 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2018）12-0074-3
金线莲别名金线兰、金丝草，为兰科开唇植物花叶兰属多年生珍稀中草药，使用范围广泛，素有“药王”、“金不换”、“乌人参”等美称。由于金线莲对生长条件要求苛刻，自然繁殖率低，生长缓慢，加上人为过度采挖，致使野生资源濒临绝种。福建省武夷山属亚热带海洋性湿润季风气候，夏无酷暑，冬无严寒，雨量充沛，光热充足，相对湿度较大。得天独厚的地理、气候、水文条件及森林效应，形成了特殊的生态条件，为金线莲生长创造了理想的生态环境，境内金线莲种质资源丰富，药用价值高。近年来，南平市规划创建武夷新区生物产业核心区，同时也在积极建立天然药物药材良种繁育示范基地，以地道药材为基础，建设地道植物药材培育示范基地，逐步建成集原料引种试验、良种繁育、示范、观光于一体的示范带动区域。优质的种质资源是发展生物医药产业的先决条件，为此笔者以武夷山境内经过良种选育出来的野生金线莲种苗作为试验对象开展组培技术的研究，为武夷山脉金线莲道地药材的工厂化生产提供技术支撑。
1 材料与方法
1.1 试验材料 试验材料取自福建省武夷山境内，以经过选优的野生金线莲种苗作为外植体。
1.2 培养基配制和培养条件 以MS作为基本培养基，根据需要添加不同浓度的KT、NAA、IBA等植物激素，并附以琼脂0.6%、蔗糖3%，调整pH值为5.6～5.8，煮沸，待琼脂融化后分装到组培瓶中，在121℃下高压灭菌18～20min，取出冷却凝固后待用。将培养苗置于光照培养架下培养，培养室温度设置在23～27℃，光照强度1500～2000lx，光照时数12h·d-1。
1.3 试验方法
1.3.1 材料的表面灭菌 将取回的野生金线莲种苗剪去叶片后用自来水冲洗干净。接着拿到接种室超净工作台上用75%酒精浸泡外植体20s，无菌水冲洗1次后再进行消毒处理对比试验。把消毒好的外植体剪切成带芽的茎段，接种到诱导培养基中进行培养，30d后统计比较消毒效果，筛选出最佳的外植体消毒方法。消毒试验共设计3个处理（10%次氯酸钙溶液消毒5min+0.1%HgCl2消毒5min、10%次氯酸钙溶液消毒15min、0.1%HgCl2消毒10min）。
1.3.2 芽诱导与增殖培养 本试验选择在MS基本培养基的基础上，外加不同浓度水平的KT和IBA激素，按正交设计组成9个处理，每个处理接种50个茎段，重复3次，40d后统计芽分化数及分化情况。
1.3.3 壮苗与生根培养 将诱导出的芽苗接种到添加不同浓度马铃薯泥的培养基中，研究不同浓度马铃薯泥对金线莲壮苗与生根培养的影响。各试验不同处理、水平代号见表1～表3所示。
2 结果与分析
2.1 不同消毒方法对外植体诱导存活的影响 外植体在接种之前，必须经过严格地消毒灭菌，特别是野外采集回来的外植体，因在自然环境下生长带菌量大，增加消毒的难度。外植体消毒的基本原则是既要彻底地杀灭各种有害菌，又不致于过度损伤组织材料，而影响生长。由表4可知，3种不同消毒处理中，以10%次氯酸钙溶液消毒15min效果好，外植体存活率高，达70%，10%次氯酸钙溶液消毒5min+0.1%HgCl2消毒5min效果次之，达53.3%，单纯用0.1%HgCl2消毒10min效果最差，外植体存活率仅为30%。这可能是因为野生金线莲茎段组织幼嫩，细胞壁薄，而HgCl2溶液较次氯酸钙具有较强的细胞渗透能力，过长消毒时间对组织细胞具有明显的毒害作用，影响外植体存活。因此，武夷山脉金线莲外植体消毒处理应以10%次氯酸钙溶液消毒为主，时间以15min为宜。
2.2 芽诱导与增殖培养 金线莲增殖快繁技术可以通过原球茎增殖和芽苗增殖2种方式进行，采用芽苗增殖方式可以保持原种的优良特性，为良种快繁最主要采用的方式。通过芽苗增殖方式除了选择正确的培养基和适宜的培养环境外，最主要的影响还在于生长调节物质种类和配比浓度。我国植物生理学家发现适宜的细胞分裂素与生长素的浓度比，可以有效地控制植物组织培养过程中芽和根的发生。
由表5可知，培养基中添加KT与IBA激素组合可以有效促进金线莲芽苗增殖。不同浓度激素组合对金线莲芽苗的诱导与增殖影响较大，芽苗的分化系數变动范围为1.72～3.40。本试验中，以中浓度的KT与中高浓度的IBA配合促进芽的增殖效果最明显，芽苗分化系数可达3.0以上。高浓度的KT对金线莲芽的诱导有明显的抑制作用，生长素IBA对芽的伸长生长有明显的促进作用。在试验使用的KT与IBA激素组合中，以KT0.5mg·L-1+IBA0.2mg·L-1组合效果最佳，分化系数达3.40，这对于武夷山脉金线莲组培快繁生产具有重要的现实意义。
2.3 壮苗与生根培养 兰科类植物在组织培养过程中需要添加一定量的马铃薯泥、香蕉泥或椰子汁，可有利于促进培育健壮的植株。在本试验中，通过培养基中添加一定浓度的马铃薯泥（先煮熟再用搅拌机搅成糊状），研究不同浓度的马铃薯泥对芽苗增壮和生根培养的影响。从表6分析得知，培养基中添加一定浓度的马铃薯泥对金线莲植株的生长与生根培养具有明显的促进作用。当每升培养基中添加100g·L-1的马铃薯泥时，金线莲芽苗茎杆粗壮，叶色深绿，芽苗健壮，根数可达3～5条，基本符合驯化移栽的要求，过多或过少均不利于壮苗与生根培养。 2.4 炼苗与移栽 当金线莲瓶苗根系长至1.5～2.5cm左右时，应将生根瓶苗搬到驯化室进行自然环境中炼苗培养。经过约30～50d左右的炼苗培养后，当芽苗茎杆颜色转为褐色，叶片肥厚时，打开瓶盖，再炼苗1～2d，然后小心取出，洗净根部附着的培养基，移植于经过消毒处理的混合基质中。种植前7d，用0.1%高锰酸钾溶液对基质进行消毒。金线莲性喜阴凉、潮湿、通风的环境，基质要求疏松通气。移栽基质应以腐殖土为主，外加一定量的珍珠岩，移栽后应严格控制浇水量，只要保持基质湿润即可。晴天应加盖2层遮阳网，以减少阳光直射，避免灼伤。7d后，可喷多菌灵800倍或托布津1000～1200倍溶液杀菌。经过30d精心培育，小苗平均成活率达95%以上。
3 结论与讨论
（1）外植体灭菌处理应选择合适的消毒剂和消毒方法，既要保证外植体能彻底灭菌，又不至于过度地伤害外植体细胞。武夷山脉金线莲的嫩茎在10%次氯酸钙溶液消毒15min处理下，外植体存活率最高，达70.0%。
（2）武夷山脉金线莲嫩茎诱导与增殖培养基以KT 0.5mg·L-1+IBA0.2mg·L-1组合效果最佳，分化系数达3.40，这对于武夷山脉金线莲组培快繁生产具有重要的现实意义。
（3）在壮苗与生根培养过程中，培养基中添加100g·L-1马铃薯泥有利于促进芽苗的健壮生长，培育壮苗。
（4）金线莲性喜阴凉潮湿通风环境，在移栽管理过程中，应严格控制浇水量，保持基质湿润即可，同时注意做好通风降温遮光处理，经过40d的精心培育，平均成活率可达95%以上。
参考文献
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[11]陈裕等.金线莲生长发育与光照强度关系[J].福建热作科技，1996，21（4）：22-23.
[12]]郑维鹏.金线莲组培与移栽技术的研究[J].福建林学院学报，1995，15（4）：337-341.
（责编：张宏民）