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摘要：芽孢杆菌已被广泛应用于微生物肥料的生产。以巨大芽孢杆菌11433作为出发菌株，对其进行紫外诱变，根据平板解磷圈直径与菌落直径比值进行初筛，再根据解磷能力进行复筛，并最终获得一株高效解磷菌。该菌株的摇瓶试验结果表明，发酵3 d后，pH值从7.00降到了4.03，其解磷含量可达到46.79 μg/mL，较出发菌株11433的产量提高了115.62%，且其遗传稳定性良好。以得到的高产菌11433-D作为研究对象，对其解磷机理进行分析。发现有机酸的产生促进了解磷量的提高且使发酵液pH值降低。气相色谱质谱和高效液相色谱检测发现，巨大芽孢杆菌发酵液中的主要代谢产物为葡萄糖酸、乙酸、丙酸。
关键词：巨大芽孢杆菌；诱变育种；解磷机理；高效液相色谱
中图分类号： S182文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2016）12-0537-03
收稿日期：2015-10-21
基金项目：天津市科技计划（编号：14ZCZDTG0025）。
作者简介：任友花（1989—），女，山东临沂人，硕士研究生，主要研究方向微生物发酵制剂。E-mail：renyouhua123456@163.com。
通信作者：乔长晟，博士，教授，主要研究方向为生物高分子及食品生物学。Tel：（022）25328451；E-mail：qiaochangsheng@tust.edu.cn。
磷在农业中起到重要作用，土壤有效磷的缺乏导致植物减产[1-2]。磷肥的施用能够促进各种代谢正常进行，植物生长发育良好，同时可提高植物的抗寒性和抗旱性。肥料中70%以上的水溶性磷与土壤中的Ca2 、Fe3 、Al3 等结合，转化为难溶性磷酸盐，很难被植物吸收利用[3]。然而巨大芽孢杆菌不但能分解有机磷物质，而且也能分解难溶性磷化合物[4]。因此，在农业上常被用来做磷细菌肥料。
紫外线是一种使用最早、沿用最久、应用广泛、效果明显的物理诱变剂。尽管几十年来，不断有各种新的诱变剂出现和应用于诱变育种，但到目前为止，经诱变处理后得到的微生物肥料高产菌中，有80%左右是通过紫外线诱变后筛选获得的。紫外线迄今仍然是微生物育种中最常用和有效的诱变剂之一[5-6]。卢金珍等研究表明，采用蒙金娜有机磷培养基对巨大芽孢杆菌进行紫外诱变，其解磷能力达到16.85 mg/mL，比出发菌株提高了117.7%[7]。
微生物溶解无机磷的机理复杂，研究认为，一些微生物解磷主要是其分泌质子的溶解作用，另一些猜测认为是小分子有机酸的酸溶和螯合作用。虞伟斌等研究表明，有机酸的螯合作用是解磷菌K3解磷的主要机理[8]。研究表明，巨大芽孢杆菌有机酸主要代谢产物是葡萄糖酸、乳酸和乙酸[9]。伊鋆研究发现，产气肠杆菌在溶磷过程中可能是主要通过增强细胞内TCA循环而增加体系能量，从而获得较多种类和含量的有机酸[10]。
本试验以解磷能力较强的巨大芽孢杆菌11433为出发菌株，进行紫外诱变，获得高效解磷菌株，进而对解磷菌发酵液中的有机酸与溶磷量的关系进行了探索，为该菌株在微生物肥料中的应用提供理论依据。
1材料与方法
1.1试验主要仪器（表1）和主要试剂
衍生化试剂：甲氧基铵盐酸盐/吡啶溶液（色谱纯，Fluka公司），色谱纯N-甲基-N-（三甲基硅烷）三氟乙酰胺（MSTFA），（购自Fluka公司）；色谱纯吡啶（纯度：99.8%），购自美国Sigma公司。试验用水为Milli-Q超纯水。葡萄糖酸、乙酸、柠檬酸等标准样品，分析纯。
1.2菌株与培养基
菌种来源：巨大芽孢杆菌11433，中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号1.223。
营养琼脂培养基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，氯化钠 5 g/L，琼脂20 g/L，pH值7.0～7.2，121 ℃ 20 min灭菌。
种子培养基：葡萄糖10 g/L，K2HPO4·3H2O 6 g/L，KH2PO4 3 g/L，尿素1.5 g/L，酵母粉1 g/L，MgSO4·7H2O 041 g/L，pH值 7.0，121 ℃ 20 min灭菌。
无机磷发酵培养基：葡萄糖10 g/L，（NH4）2SO4 0.5 g/L，NaCl 0.3 g/L，KCl 0.3 g/L，MgSO4·7H2O 0.3 g/L，FeSO4·7H2O 0.03 g/L，MnSO4·H2O 0.03 g/L，Ca3（PO4）2 5 g/L，pH值70～7.5，121 ℃ 20 min 灭菌。
无机磷固体培养基：葡萄糖10 g/L，（NH4）2SO4 0.5 g/L，NaCl 0.3 g/L，KCl 0.3 g/L，MgSO4·7H2O 0.3 g/L，FeSO4·7H2O 0.03 g/L，MnSO4·H2O 0.03 g/L，Ca3（PO4）2 5 g/L，琼脂 20 g/L，pH值7.0～7.5，121 ℃ 20 min滅菌。
1.3高效解磷菌的筛选
1.3.1种子液制备将4 ℃斜面保存的巨大芽孢杆菌活化，将其分别划线于营养琼脂培养基上，37 ℃培养24 h，挑取活化的菌落，接于种子培养基，37 ℃、200 r/min培养20 h。
1.3.2发酵培养
将种子液按5%接种量接入无机磷发酵培养基，37 ℃、200 r/min摇床培养4 d，同时设置不接种作为对照培养。
1.3.3菌株的诱变处理方法
菌株的诱变处理采用紫外诱变方法，诱变处理的流程为：出发菌株孢子悬液→紫外诱变→根据解磷圈直径与菌落直径比值初筛→摇瓶复筛→斜面保存、遗传稳定性试验。
将磁力搅拌器置于功率为30 W的紫外灯下30 cm处，打开紫外灯，以稳定波长预先照射20 min杀菌。无菌移液管移取 1 mL，放入盛有99 mL无菌水的三角瓶中，振荡5 min充分摇匀，使细菌分散。将样品稀释成为10-2 CFU/mL菌悬液。取5 mL制作的孢子悬液于直径7 cm带有转子的平皿中。将平皿放在诱变箱的磁力搅拌器上，开启磁力搅拌器，打开皿盖，分别照射0、15、30、45、60、75、90、120 s。将照射处理的孢子悬液分别进行梯度稀释，取各照射剂量10-8～10-5稀释度的孢子悬液0.1 mL分别涂布平皿，每个梯度做3个平行。37 ℃ 避光的环境下，将平皿倒置培养18～26 h，观察平皿上解磷圈和菌落的生长情况。以未经紫外线处理（处理 0 s）的孢子悬浮液涂布的平皿作对比，计算致死率，以紫外照射时间为横坐标，致死率为纵坐标绘制致死率曲线。 1.3.4解磷菌的筛选
1.3.4.1解磷菌的初筛
根据诱变存活菌株在解磷培养基上形成的解磷圈直径与菌落直径比值观察诱变效果，筛选比值大于出发菌株15%的为正突变，小于15%的为负突变，进行复筛。
1.3.4.2解磷菌的复筛
采用“1.3.1”节和“1.3.2”节的方法摇瓶培养，加入0.5%质量浓度经酸洗碱洗后的无磷活性炭，发酵液15 000 r/min，离心10 min，取上清液，据国标NY 412—2000中所述方法以钼锑抗比色法测定速效磷含量。以菌株发酵液含磷量减去不接菌的空白对照发酵液含磷量衡量菌株的解磷能力，同时测定菌株不同时间段的pH值变化。
1.3.4.3遗传稳定性试验
将筛选出的高产菌株D在斜面培养基上连续转接5代，根据钼锑抗比色法测定有效磷含量，检测其遗传稳定性。
1.3.5种子生长曲线测定
本试验以菌株11433-D为研究对象，将甘油管保存的孢子悬液0.8 mL接种于种子培养基，37 ℃、200 r/min摇床培养18 h得到一级种子液。按2%的接种量将一级种子液接种至含300 μL培养基的生长板中，37 ℃条件下在全自动生长曲线分析仪上培养48 h，每隔2 h取样测定1次D600 nm，3个平行样。试验结束后，根据培养过程中不同时间的吸光度，绘制D600 nm与培养时间（h）的关系曲线。
1.4解磷机理的探讨
1.4.1气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）测定有机酸
无机磷发酵液离心—冷冻干燥—衍生化—气质检测。
1.4.1.1样品的处理
取5 mL发酵液在10 000 r/min条件下离心10 min，取上清100 μL，加入10 μL内标混合液，混匀后真空冷冻干燥。
1.4.1.2样品的衍生化
冻干后样品加50 μL甲氧基铵盐酸盐/吡啶溶液（20 mg/mL），涡旋使冻干的样品充分溶解，置于40 ℃水浴反应80 min；加80 μL MSTFA（N-甲基-N-（三甲基硅烷）三氟乙酰胺溶液，混合均匀，置于40 ℃水浴反应80 min；将衍生化后的样品10 000 r/min离心5 min；取上清液100 μL装于进样瓶中，并编号，室温放置2 h，准备进行GC-MS 检测。
1.4.1.3主要色谱条件
色谱柱：硅色谱柱[DB-5MS，30 m （长）×0.25 mm（内径）×0.25 μm（膜厚）]，购自J
关键词：巨大芽孢杆菌；诱变育种；解磷机理；高效液相色谱
中图分类号： S182文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2016）12-0537-03
收稿日期：2015-10-21
基金项目：天津市科技计划（编号：14ZCZDTG0025）。
作者简介：任友花（1989—），女，山东临沂人，硕士研究生，主要研究方向微生物发酵制剂。E-mail：renyouhua123456@163.com。
通信作者：乔长晟，博士，教授，主要研究方向为生物高分子及食品生物学。Tel：（022）25328451；E-mail：qiaochangsheng@tust.edu.cn。
磷在农业中起到重要作用，土壤有效磷的缺乏导致植物减产[1-2]。磷肥的施用能够促进各种代谢正常进行，植物生长发育良好，同时可提高植物的抗寒性和抗旱性。肥料中70%以上的水溶性磷与土壤中的Ca2 、Fe3 、Al3 等结合，转化为难溶性磷酸盐，很难被植物吸收利用[3]。然而巨大芽孢杆菌不但能分解有机磷物质，而且也能分解难溶性磷化合物[4]。因此，在农业上常被用来做磷细菌肥料。
紫外线是一种使用最早、沿用最久、应用广泛、效果明显的物理诱变剂。尽管几十年来，不断有各种新的诱变剂出现和应用于诱变育种，但到目前为止，经诱变处理后得到的微生物肥料高产菌中，有80%左右是通过紫外线诱变后筛选获得的。紫外线迄今仍然是微生物育种中最常用和有效的诱变剂之一[5-6]。卢金珍等研究表明，采用蒙金娜有机磷培养基对巨大芽孢杆菌进行紫外诱变，其解磷能力达到16.85 mg/mL，比出发菌株提高了117.7%[7]。
微生物溶解无机磷的机理复杂，研究认为，一些微生物解磷主要是其分泌质子的溶解作用，另一些猜测认为是小分子有机酸的酸溶和螯合作用。虞伟斌等研究表明，有机酸的螯合作用是解磷菌K3解磷的主要机理[8]。研究表明，巨大芽孢杆菌有机酸主要代谢产物是葡萄糖酸、乳酸和乙酸[9]。伊鋆研究发现，产气肠杆菌在溶磷过程中可能是主要通过增强细胞内TCA循环而增加体系能量，从而获得较多种类和含量的有机酸[10]。
本试验以解磷能力较强的巨大芽孢杆菌11433为出发菌株，进行紫外诱变，获得高效解磷菌株，进而对解磷菌发酵液中的有机酸与溶磷量的关系进行了探索，为该菌株在微生物肥料中的应用提供理论依据。
1材料与方法
1.1试验主要仪器（表1）和主要试剂
衍生化试剂：甲氧基铵盐酸盐/吡啶溶液（色谱纯，Fluka公司），色谱纯N-甲基-N-（三甲基硅烷）三氟乙酰胺（MSTFA），（购自Fluka公司）；色谱纯吡啶（纯度：99.8%），购自美国Sigma公司。试验用水为Milli-Q超纯水。葡萄糖酸、乙酸、柠檬酸等标准样品，分析纯。
1.2菌株与培养基
菌种来源：巨大芽孢杆菌11433，中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号1.223。
营养琼脂培养基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，氯化钠 5 g/L，琼脂20 g/L，pH值7.0～7.2，121 ℃ 20 min灭菌。
种子培养基：葡萄糖10 g/L，K2HPO4·3H2O 6 g/L，KH2PO4 3 g/L，尿素1.5 g/L，酵母粉1 g/L，MgSO4·7H2O 041 g/L，pH值 7.0，121 ℃ 20 min灭菌。
无机磷发酵培养基：葡萄糖10 g/L，（NH4）2SO4 0.5 g/L，NaCl 0.3 g/L，KCl 0.3 g/L，MgSO4·7H2O 0.3 g/L，FeSO4·7H2O 0.03 g/L，MnSO4·H2O 0.03 g/L，Ca3（PO4）2 5 g/L，pH值70～7.5，121 ℃ 20 min 灭菌。
无机磷固体培养基：葡萄糖10 g/L，（NH4）2SO4 0.5 g/L，NaCl 0.3 g/L，KCl 0.3 g/L，MgSO4·7H2O 0.3 g/L，FeSO4·7H2O 0.03 g/L，MnSO4·H2O 0.03 g/L，Ca3（PO4）2 5 g/L，琼脂 20 g/L，pH值7.0～7.5，121 ℃ 20 min滅菌。
1.3高效解磷菌的筛选
1.3.1种子液制备将4 ℃斜面保存的巨大芽孢杆菌活化，将其分别划线于营养琼脂培养基上，37 ℃培养24 h，挑取活化的菌落，接于种子培养基，37 ℃、200 r/min培养20 h。
1.3.2发酵培养
将种子液按5%接种量接入无机磷发酵培养基，37 ℃、200 r/min摇床培养4 d，同时设置不接种作为对照培养。
1.3.3菌株的诱变处理方法
菌株的诱变处理采用紫外诱变方法，诱变处理的流程为：出发菌株孢子悬液→紫外诱变→根据解磷圈直径与菌落直径比值初筛→摇瓶复筛→斜面保存、遗传稳定性试验。
将磁力搅拌器置于功率为30 W的紫外灯下30 cm处，打开紫外灯，以稳定波长预先照射20 min杀菌。无菌移液管移取 1 mL，放入盛有99 mL无菌水的三角瓶中，振荡5 min充分摇匀，使细菌分散。将样品稀释成为10-2 CFU/mL菌悬液。取5 mL制作的孢子悬液于直径7 cm带有转子的平皿中。将平皿放在诱变箱的磁力搅拌器上，开启磁力搅拌器，打开皿盖，分别照射0、15、30、45、60、75、90、120 s。将照射处理的孢子悬液分别进行梯度稀释，取各照射剂量10-8～10-5稀释度的孢子悬液0.1 mL分别涂布平皿，每个梯度做3个平行。37 ℃ 避光的环境下，将平皿倒置培养18～26 h，观察平皿上解磷圈和菌落的生长情况。以未经紫外线处理（处理 0 s）的孢子悬浮液涂布的平皿作对比，计算致死率，以紫外照射时间为横坐标，致死率为纵坐标绘制致死率曲线。 1.3.4解磷菌的筛选
1.3.4.1解磷菌的初筛
根据诱变存活菌株在解磷培养基上形成的解磷圈直径与菌落直径比值观察诱变效果，筛选比值大于出发菌株15%的为正突变，小于15%的为负突变，进行复筛。
1.3.4.2解磷菌的复筛
采用“1.3.1”节和“1.3.2”节的方法摇瓶培养，加入0.5%质量浓度经酸洗碱洗后的无磷活性炭，发酵液15 000 r/min，离心10 min，取上清液，据国标NY 412—2000中所述方法以钼锑抗比色法测定速效磷含量。以菌株发酵液含磷量减去不接菌的空白对照发酵液含磷量衡量菌株的解磷能力，同时测定菌株不同时间段的pH值变化。
1.3.4.3遗传稳定性试验
将筛选出的高产菌株D在斜面培养基上连续转接5代，根据钼锑抗比色法测定有效磷含量，检测其遗传稳定性。
1.3.5种子生长曲线测定
本试验以菌株11433-D为研究对象，将甘油管保存的孢子悬液0.8 mL接种于种子培养基，37 ℃、200 r/min摇床培养18 h得到一级种子液。按2%的接种量将一级种子液接种至含300 μL培养基的生长板中，37 ℃条件下在全自动生长曲线分析仪上培养48 h，每隔2 h取样测定1次D600 nm，3个平行样。试验结束后，根据培养过程中不同时间的吸光度，绘制D600 nm与培养时间（h）的关系曲线。
1.4解磷机理的探讨
1.4.1气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）测定有机酸
无机磷发酵液离心—冷冻干燥—衍生化—气质检测。
1.4.1.1样品的处理
取5 mL发酵液在10 000 r/min条件下离心10 min，取上清100 μL，加入10 μL内标混合液，混匀后真空冷冻干燥。
1.4.1.2样品的衍生化
冻干后样品加50 μL甲氧基铵盐酸盐/吡啶溶液（20 mg/mL），涡旋使冻干的样品充分溶解，置于40 ℃水浴反应80 min；加80 μL MSTFA（N-甲基-N-（三甲基硅烷）三氟乙酰胺溶液，混合均匀，置于40 ℃水浴反应80 min；将衍生化后的样品10 000 r/min离心5 min；取上清液100 μL装于进样瓶中，并编号，室温放置2 h，准备进行GC-MS 检测。
1.4.1.3主要色谱条件
色谱柱：硅色谱柱[DB-5MS，30 m （长）×0.25 mm（内径）×0.25 μm（膜厚）]，购自J